文献速递 | 乳酸通过PTS-CRP促进荚膜多糖合成，加剧肺炎克雷伯菌肝脓肿侵袭性

文章题目：Lactate promotes invasive Klebsiella pneumoniae liver abscess syndrome by increasing capsular polysaccharide biosynthesis via the PTS-CRP axis

文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61379-9

发表时间：2025.7

发表期刊：Nature communications

IF：15.7

研究背景

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）已成为肝脓肿（LA）的主要致病菌，约20%的LA病例会进展为侵袭性肝外迁移性感染（EMIs），如眼内炎、脑膜炎和坏死性筋膜炎，这类重症感染被定义为侵袭性肺炎克雷伯菌肝脓肿综合征（IKPLAS）。尽管采用积极治疗，IKPLAS的死亡率仍高达20%，凸显其临床危害性。

研究表明，KP的高毒力表型是驱动IKPLAS进展的关键因素，其中荚膜多糖（CPS）和铁载体是已知的核心毒力因子。然而，既往研究多局限于IKPLAS的临床表现、治疗及细菌分子特征，对宿主-病原体互作在致病机制中的作用认识不足。因此，深入探索宿主微环境与细菌毒力的动态调控关系，将为揭示IKPLAS的完整发病机制提供新视角。

技术路线

机制概述

乳酸积累→Man-PTS EII下调→cAMP合成减少→CRP活性降低→解除对CPS基因的抑制→CPS生物合成增加→毒力增强

研究方法

*药敏试验（MIC）

*拉丝试验（HMV）

*全基因组测序、组装、注释

*Kleborate预测（ST、血清型和耐药谱/毒力谱）

*SNP系统发育树构建

*转录组测序

*糖醛酸定量检验

qRT-PCR定量检验

巨噬细胞吞噬实验

血清杀伤实验

小鼠感染模型存活实验

细菌菌落计数

组织病理学分析

ELISA测定

*缺失突变体和回补突变体构建

*表示本公司上海唯那生物提供该组学分析或实验服务

研究结果

1、分组差异比较

比较KPLA（n=38）和IKPLAS（n=30）患者的KP分离株：

黏液表型——拉丝实验（图1a、1b）

分子分型——ST（图1c）、K type（图1d）

耐药毒力——毒力基因（图1e）、耐药基因（图1f）

结果显示两者无显著差异，表明细菌的分子特征并不是 IKPLAS的主要驱动因素。

图1 KPLA和IKPLAS肺炎克雷伯菌分子特征比较（a-b.拉丝实验；c. ST；d. K type； e-f. Kleborate毒力/耐药评分）

2、系统发育分析

比较国内（n=68）和国外（n=49）的 LA-KP菌株，确认本研究分离株与全球已发表LA菌株的克隆相关性。系统发育树基于单核苷酸多态性（SNP）构建。

进化树主要包括ST23、 ST65和 ST86集群，每个集群都含有本研究的分离株和来自其他国家的参考菌株，说明国内外的LA-KP在遗传上密切相关，本研究的分离株可以代表全球菌株的情况。

图2 117株肝脓肿肺炎克雷伯菌的系统发育结构

3、临床数据分析

通过单变量和多变量分析筛选潜在风险因素 (P＜0.05)，发现血乳酸水平升高是重要因素。

进一步比较IKPLAS患者相对RTI患者、UTI患者、健康人的血乳酸水平，发现明显升高。

推测乳酸在驱动肝脓肿微环境的 IKPLAS方面起关键作用。

表1 IKPLAS发生的风险因素分析

4、毒力因子鉴定和毒力实验检测

1）鉴定肺炎克雷伯菌受乳酸调节的毒力因子

基于乳酸上调关键毒力因子增强微生物致病性的先前证据，作者通过RT-PCR比较了不同乳酸钠（Lac）浓度下荚膜多糖（CPS）和铁载体表达的差异。结果显示在 40 mM乳酸钠时CPS产生达到峰值（糖醛酸定量，图3a）；且与单独使用 LB相比，添加乳酸钠的组HMV表型增强（图3b），CPS合成簇基因表达增加（图3c-e），而铁载体相关基因表达不变（补充图1）。这说明，乳酸主要是通过促进CPS产生而非铁载体调节来增强肺炎克雷伯菌毒力。后续作者进一步通过cps敲除实验验证了CPS对乳酸介导毒力增强的重要性。

图3乳酸促进临床肺炎克雷伯菌分离株CPS产生（a. CPS定量；b. HMV；c-e. CPS编码基因表达的RT-PCR分析；f.巨噬细胞吞噬；g.血清抗性检验；h-k.巨噬细胞促炎细胞因子）

2）探讨乳酸对肺炎克雷伯菌毒力的影响（体外实验）

与单独使用 LB相比，添加乳酸钠的组抗巨噬细胞吞噬作用（图3f）、抗血清杀灭作用增强（图3g），且促炎细胞因子检测结果显示（图3h-k），白细胞介素 1β（IL-1β）转录和蛋白表达增加，而白细胞介素 6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNFα）保持不变。这表明，乳酸可以增强肺炎克雷伯菌的抗吞噬特性，从而引发更强的炎症反应。

3）探讨乳酸对肺炎克雷伯菌毒力的影响（体内实验）

基于LA-小鼠模型（图4a），Lac-LB组相较LB组，小鼠的死亡率显著升高（图4b）。对感染严重程度的评估显示，Lac-LB组脓肿大小增大、血清炎性细胞因子升高、中性粒细胞浸润增多以及肝组织、肝细胞完整性明显破坏（图4c-h）。这些发现说明，乳酸诱导的毒力增强促进了肺炎克雷伯菌在小鼠体内更具侵袭性的感染。

图4乳酸增强小鼠肺炎克雷伯菌毒力（a.小鼠肝脓肿模型；b.小鼠存活曲线；c.肝组织病理学检验；d小鼠组织细菌载量；e-f.小鼠促炎细胞因子；g-h.累积病变评分）

5、乳酸诱导CPS上调的机制研究

1）研究乳酸诱导CPS上调的分子机制

通过转录组测序（RNA-seq）分析LB和 40 mM Lac-LB培养的差异，鉴定了 327个差异表达基因（DEGs），包括 155个上调和 172个下调基因（图 5a）。KEGG通路富集分析显示，很大一部分 DEGs与 PTS系统有关（图5b），该系统主要负责糖的转运和磷酸化，由酶I（EI）、组氨酸磷酸化蛋白（HPr）和酶 II（EII）组成。其中，甘露糖特异性 PTS（man-PTS）显示最多的 DEGs，包括编码EII的gfrA、gfrB、gfrC和 gfrD基因，表明 man-PTS在乳酸介导的 CPS上调中起关键作用（补充图6）。RT-PCR的gfrA、gfrB、gfrC和 gfrD评估结果与转录组一致，与LB组相比，Lac-LB组的表达显著降低（图5c）。综上合理假设，乳酸诱导的 man-PTS EII下调可能有助于 CPS生物合成的增加。

图5乳酸诱导肺炎克雷伯菌的转录组测序和DEGs分析（a. DEGs火山图；b.DEGs-KEGG通路富集分析；c.验证gfrA、gfrB、gfrC和gfrD表达）

2）验证Man-PTS EII对CPS产生的影响

通过敲除gfrA-D基因构建Δman-PTS EII突变体，与野生型（WT）相比，Δman-PTS EII突变体的CPS产生增加、CPS基因簇上调。man-PTS EII回补后，CPS产生恢复到WT相似水平。另外，添加乳酸并不能使Δman-PTS EII突变体的 CPS产生和基因表达增加（图6a-d），抗吞噬能力也没有增强（图6e）。这些结果支持了由man-PTS EII介导乳酸诱导的 CPS产生增加的假设。

然后使用LA-小鼠模型比较 WT菌株和 Δman-PTS EII突变体的毒力。Δman-PTS EII突变体小鼠在组织中表现出明显更高的细菌载量、血清IL-6水平升高和更严重的肝脏炎症（图6f-k），且死亡率明显更高（图6l）。这些结果表明，乳酸诱导的man-PTS EII下调增强了肺炎克雷伯菌的毒力。

图6与野生型相比，man-PTS EII敲除突变体产生更多CPS并诱导更严重感染（a. CPS定量；b-d. CPS编码基因表达的RT-PCR分析；e.巨噬细胞吞噬；f.组织细菌载量；g.肝组织病理学检验；h-i.组织学和MPO评分；j-k.促炎细胞因子水平；l.小鼠存活曲线）

3）研究man-PTS EII下调如何促进CPS产生

根据先前的研究，作者假设乳酸诱导的man-PTS EII下调降低了细胞内cAMP水平。并在LB和 Lac-LB培养时测量了WT菌株、Δman-PTS EII突变体和C-Δman-PTS EII回补菌株中的细胞内 cAMP水平。与单独使用 LB相比，WT菌株在 Lac-LB中生长时 cAMP水平显著降低。Δman-PTS EII突变体的 cAMP水平低于 WT和回补菌株，且在 Lac-LB条件下突变体的 cAMP水平没有进一步降低（图 7a）。

为探究cAMP在调节 CPS产生和 HMV中的作用，作者在补充有cAMP的Lac-LB中培养肺炎克雷伯菌，结果显示外源性 cAMP显著抑制了CPS产生和HMV（图7b-c）。已知cAMP通过 cAMP受体蛋白（CRP）发挥作用，而CRP是 CPS生物合成的负调节因子。因此，作者通过构建Δcrp突变体来研究CRP在乳酸诱导的 CPS上调中的作用。与 WT菌株相比，Δcrp突变体表现出 CPS产生显著增加和 CPS基因簇上调。然而，与单独使用 LB相比，在 Lac-LB中培养 Δcrp突变体并没有进一步增加 CPS的产生或基因表达（图 7d-e）。这些结果表明，乳酸诱导的 man-PTS EII下调通过抑制 cAMP-CRP调节子增强了 CPS生物合成。

图7 Man-PTS EII的下调通过cAMP-CRP调节子促进CPS的生物合成（a. cAMP浓度；b. CPS定量；c. HMV；d. CPS定量；e. CPS基因簇转录表达）

总结

本研究分析了IKPLAS的分子机制，发现乳酸通过PTS-CRP途径增加荚膜多糖生物合成，从而促进肺炎克雷伯菌的侵袭性。研究对比了KPLA患者和IKPLAS患者的细菌分子特征，未发现显著差异，但发现血液中乳酸水平升高是IKPLAS的独立预测因素。乳酸通过降低cAMP水平，进而减少cAMP与CRP的结合，增强荚膜多糖的合成，提高细菌的毒力。这项研究揭示了乳酸在IKPLAS发病机制中的作用，为开发有效的治疗策略提供了新见解。

参考文献

Zhu J, Wang G, Xi W, et al. Lactate promotes invasive Klebsiella pneumoniae liver abscess syndrome by increasing capsular polysaccharide biosynthesis via the PTS-CRP axis. Nat Commun. 2025;16(1):6057.