Nature reviews microbiology | 肺炎克雷伯菌的群体基因组学研究

背景知识：

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae) 属于肠杆菌科，其中包括沙门氏菌属 （Salmonella）和埃希氏菌属（Escherichia）。肺炎克雷伯菌是世界上最常见的医院病原体之一，也是新生儿败血症的主要原因。世界卫生组织认识到产生广谱β-内酰胺（ESBL）和耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKp）是一种严重的公共卫生威胁。据报道，仅在欧洲，此类菌株每年就有90，000例以上感染，每年7，000例以上死亡，占多重耐药（MDR）细菌感染丧失的残疾调整生命年总数的25%。

除了作为医院病原体的重要性之外，肺炎克雷伯菌还可以生活在广泛的宿主相关和环境生态位中，并表现出广泛的表型和遗传多样性。然而，关于这种遗传多样性如何在细菌种群内（即物种种群结构）以及这与生物体的生态或其引起不同类型疾病的能力之间的关系知之甚少。例如，尽管已经描述了毒力质粒，但是绝大多数来自临床感染的分离物中不存在毒力质粒。高通量基因组分析使我们能够查询和比较数百或数千个肺炎克雷伯菌的整个遗传互补，并揭示了该病原体种群结构，帮助我们更好地了解其如何进化，传播和导致疾病。例如，目前的数据表明，与抗菌素耐药性（AMR）和毒力相关的基因各自集中在肺炎克雷伯菌的不同亚群中。

主要讨论的内容：

该篇综述中，主要讨论了基因组学方法如何提高对肺炎克雷伯菌分类学，生态学和进化的理解，以及致病性和抗菌素耐药性的临床相关决定因素的多样性和分布。

Taxonomy

全基因组测序（WGS）已经阐明，在临床和研究实验室中通过生物化学或蛋白质组学分析鉴定为肺炎克雷伯菌的大部分分离株实际上属于密切相关的物种，其平均核苷酸相似性在95-96%之间，作者将其称为肺炎克雷伯菌物种复合体（K. pneumoniaespecies complex，KpSC），与其他克雷伯氏菌物种（Klebsiella）仅具有90%的平均核苷酸相似性。

Ecology and lifestyle

肺炎克雷伯菌可以在多种生态位中生存，包括自由生活和宿主相关。这些生态位包括土壤，水，一系列植物物种，昆虫，鸟类，爬行动物和许多不同的哺乳动物，其中这种细菌既可以是共生器官，也可以是潜在的病原体。基于文化的估计表明肺炎克雷伯菌（KpSC菌株）是哺乳动物肠道的常见定居者（狗和奶牛的患病率分别为39%和44%），而基于16S rRNA序列估计表明鸟类和各种昆虫物种经常携带。

From commensal to pathogen

肺炎克雷伯菌与人类宿主之间的相互作用复杂多变，肺炎克雷伯菌可发挥共生，机会性病原体或病原体的作用。肠道和呼吸道中的共生菌群很常见，但流行率估计因年龄组，地理位置和最近的医疗保健接触而异。来自美国和澳大利亚的研究估计，社区中肠道定植的患病率约为4-6%，而在美国，澳大利亚和英国最近接受医疗保健的个体中，肠道定植的患病率高达约25%。值得注意的是，韩国，日本，新加坡，台湾和马来西亚的健康成年人估计KpSC的社区运输率较高（18%至87%）。肠道定植的持续时间尚不清楚，但可能超过12个月。

全球大多数肺炎克雷伯菌感染是机会性感染的医疗相关感染（health-care-associated infections，HAI）。最常见的表现是肺炎，尿路和伤口感染，其中任何一种都可能发展为菌血症。最危险的是易受伤害的患者群体，例如新生儿，老年人，插入医疗器械和免疫功能低下的患者。在医院环境之外，肺炎克雷伯菌可以作为一种“真正的”病原体-也就是说，它可以导致严重的社区获得性感染（community acquired infections，CAI），这些感染不被认为是机会性感染。常见的CAI包括眼内炎，肺炎，坏死性筋膜炎，非肝脓肿，脑膜炎和没有胆道疾病的化脓性肝脓肿。

Population structure

典型的肺炎克雷伯菌基因组大小约为5-6 Mbp，编码约5000-6000个基因。该物种的所有成员（核心基因）中约有1700个基因是保守的，而其余的则是可变的（辅助基因）。总泛基因组（所有核心和辅助基因的总和）极为多样化，可能超过100，000个蛋白质编码序列，大多数辅助基因在群体中是罕见的，也就是说，它们存在于<10%的基因组中。分类学GC含量分析表明，这些基因与许多其他细菌物种共享，最常见的是其他克雷伯菌属物种，其次是其他肠杆菌属，但也包括更远的目。

基于1000–2000个核心或常见染色体基因的系统发育分析表明，肺炎克雷伯菌种群包含数百个深分支谱系，它们之间的核苷酸差异约为0.5%。这些谱系与由核心基因组多位点序列分型（core-genome multilocus sequence typing，cgMLST）定义的克隆组（CG）紧密对应，作为分离株的子集，每个分离株与该组的至少一个其他成员共享694个cgMLST等位基因中的594以上。

肺炎克雷伯菌克隆可以基于辅助基因含量彼此区分。这可以通过水平基因转移（HGT）的克隆特异性生态位适应来解释。然而，尽管噬菌体介导的转导和整合接合元件（ICE）也起作用，但克隆HGT之间也有充分的证据，主要由染色体重组和质粒介导的接合驱动。染色体之间的同源重组主要由capsule biosynthesis loci（关键致病性决定因素）的交换决定，并且可以导致获得长度超过1Mbp的DNA区域。尽管IncFIIK和IncFIBK是最普遍的，但是已经从肺炎克雷伯菌测序了许多不同的质粒，其长度和不相容性类型差异很大。似乎一些肺炎克雷伯菌菌株可能对质粒摄取和/或维持特别宽容，导致质粒载量通常大于大肠杆菌和其他革兰氏阴性ESKAPE病原体报告的质粒载量。例如，肺炎克雷伯菌分离株携带4至6种不同质粒并不罕见，有时多达10种。大多数完整的肺炎克雷伯菌基因组携带多个原噬菌体，多个不同的肺炎克雷伯菌噬菌体已被分离和测序，包括作为治疗药物的潜在用途。然而，目前还没有对种群内原噬菌体多样性的系统研究。CRISPR-Cas9系统和限制性修饰系统在肺炎克雷伯菌群体中存在差异，然而，它们与质粒和噬菌体多样性的关系尚不清楚。

Global problem clones

肺炎克雷伯菌感染是由分布广泛的不同克隆引起的。然而，其中一部分对全球疾病负担的贡献不成比例，我们称之为“全球问题克隆”（图1）

Multidrug-resistant clones

MDR定义为除氨苄青霉素外对≥3种抗菌药物的耐药性，所有肺炎克雷伯菌感染都具有内在耐药性，已在数百种不同的肺炎克雷伯菌谱系中进化多次（图1a，b）。这些谱系中的一些出现引起局部问题，在单个医院或医疗保健网络内传播，例如，MDR克隆序列类型70（ST70）和ST323分别在Kilifi，肯尼亚和澳大利亚墨尔本引起爆发。这些事件可能代表在给定时间和地点出现的机会，影响其频率，可能性和持续时间的因素尚不清楚。许多仍将是局部问题，不会在其他地方造成或造成有限的感染，但是一部分抗性最高的谱系（例如，对第三代头孢菌素和/或碳青霉烯类耐药的谱系）已成为全球性问题。这些包括经过充分研究的CG258以及CG15，CG20（CG17），CG29，CG37，CG147，CG101（CG43）和CG307（图1c），它们彼此无关（图1a），但各自广泛MDR HAI和/或爆发的地理分布和常见原因。

在这里，我们将这些统称为“全球MDR克隆”，尽管它们对MDR感染负担的贡献存在重要的地理差异（参考之前的系统评价并总结图2中的最新趋势）。重要的是，尽管许多研究确实将大多数第三代头孢菌素耐药性和/或CRKp感染归因于少数克隆（在最近的全欧洲研究EuSCAPE中，CRKp感染的57%是ST11，ST15，ST101或ST258/ST512），在许多地区，归因于偶尔性MDR菌株或局部问题克隆的负担仍然很大（例如，最近在英国对CRKp进行的全国性调查中，>33%的菌株）。

显示了碳青霉烯抗性（a）和第三代头孢菌素抗性，碳青霉烯敏感性肺炎克雷伯菌（b）的序列类型（ST）的区域频率。数据来源于最近的研究，其中根据ST和当地传播事件或爆发选择分离株，并按照联合国统计司定义的区域分组。黑色和灰色位置标记分别表示来自多个和单个卫生保健机构的数据。尽管ST258及其衍生物ST512在美洲和南欧是主要的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKp），但它们在世界其他地区相对较少。ST11（通过重组衍生ST258的多样化进化枝）代表整个欧洲约12%的CRKp，并且比ST258或ST512更广泛地分布。ST11也是中国CRKp感染的单一主要原因。克隆组307（CG307）最近开始取代美洲和南欧CRKp中的ST258和ST512，并已成为南非主要的CRKp谱系，但在这些地区之外，它最常见的是碳青霉烯类敏感和第三代头孢菌素抗性（由于blaCTX-M-15质粒）。CG15（ST15，ST14和近亲）是不同地区最常见的第三代头孢菌素抗性克隆之一，并且与许多关于传播的碳青霉烯抗性变体的报道有关。

Hypervirulent clones、Antimicrobial resistance、Core genes and drug resistance、Acquired resistance genes等

与MDR感染相反，所有地区的超强毒肺炎克雷伯菌感染都由相同的谱系子集支配。到目前为止，最常见的是CG23，其次是CG65（包括ST65和ST375）和CG86，而CG25，CG66和CG380的牵连程度较小。与亚太地区高毒力疾病的高发病率相一致，CG23最近在中国，越南和老挝与肺炎克雷伯氏菌血流感染相关的前两个最常见的克隆中被确定，占分离株的10%以上。最近在其他地方对肺炎克雷伯菌耐药的特定遗传机制进行了综述，绝大多数病例与水平获得的AMR基因有关。肺炎克雷伯菌通过产生A型β-内酰胺酶SHV而对氨苄青霉素具有内在抗性，SHV由核心基因blaSHV在肺炎克雷伯菌染色体中编码（图2c）。此类A型β-内酰胺酶的直向同源物是KpSC染色体的保守特征（在变异克雷伯氏菌和克雷伯氏菌中称为LEN，在其他物种中称为OKP）。blaSHV基因已被转座酶IS26从肺炎克雷伯氏菌染色体多次捕获，形成移动遗传元件（MGE），通过质粒转移促进向其他物种的传播。值得注意的是，所得到的blaSHV移动变体通常携带导致ESBL活性（赋予对第三代头孢菌素的抗性）的点突变，并且偶尔甚至导致碳青霉烯酶活性（赋予对碳青霉烯类的抗性），并且在比染色体更强的启动子下形式。因此，一些肺炎克雷伯菌现在携带两个拷贝的blaSHV：染色体核心基因变体和在强IS26启动子控制下获得的（通常是质粒携带的）ESBL变体。这可能难以基于短读WGS数据准确鉴定肺炎克雷伯菌中存在的blaSHV等位基因，这对于准确预测β-内酰胺酶活性谱和相关耐药性是必需的。核心基因座fosA（谷胱甘肽S-转移酶）和oqxAB（外排泵）也已被MGE从肺炎克雷伯菌染色体捕获并传播给其他物种。

在肺炎克雷伯菌中观察到的大多数抗性与水平获得的辅助AMR基因相关，而不是染色体基因的突变（图1c）。这些通常是质粒携带的，但也可以整合到染色体中。除非有完整的基因组序列，否则从WGS数据计算肺炎克雷伯菌分离株中获得的AMR基因并不简单，因为这需要将染色体基因blaSHV，fosA和oqxAB与MGE编码形式区分开来。

Conclusions and future perspectives

基因组学的应用揭示了显著的遗传多样性，大大加快了对肺炎克雷伯菌种群结构、AMR、致病性和临床传播的认识。群体基因组框架有助于澄清许多与分类学、抗性和毒力相关的混淆点。这一框架也提供了重要的背景，有助于指导未来实验和临床研究的设计和解释，这些研究对于确认和阐明遗传变异与临床相关表型之间观察到的关联的机制至关重要。例如，很明显，没有“典型”肺炎克雷伯菌这样的东西，因为基因转换是广泛的，甚至“核心”基因座也有广泛的临床相关性遗传变异。考虑到这一点，实验研究可以从中受益，包括多种多样的菌株，并探索特定基因对遗传背景变化很大的因素的功能依赖性，包括等位基因和基因含量的变化。现在还有相当多的证据支持使用基因组学来跟踪医院内的菌株和/或质粒传播，以通知感染控制并帮助减轻疾病负担。然而，并非所有感染都与医院传播有关（例如，高毒力感染和散发性经典感染），并且这些不能通过增强的感染控制措施来预防。这突出表明需要更好地了解肺炎克雷伯菌与人类宿主之间的相互作用，包括核心和可变细菌机制，宿主因素以及肠道定植的作用，通常先于疾病。将比较基因组分析与目标人群调查和实验实验室研究相结合，可以证明是一种有效的方法，可以识别和功能验证其他临床相关的基因组标记。肺炎克雷伯菌的生态学研究和跨生态位监测正在普及，并且有望提供有关肺炎克雷伯菌主要动物，食物和环境储存的证据。然而，鉴于特定物种的普遍性和多样性，仅靠检测不太可能对公共卫生有益。相反，将需要进行群体基因组分析，以探索哪些储库有助于AMR和/或毒力决定因素的扩增和传播，并确定可能以疾病控制的名义中断向人类传播的途径。

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