文章解读丨大蜡螟作为研究烟曲霉毒力因子的筛选工具

文章题目：Galleria mellonella as a screening tool to study virulence factors of Aspergillus fumigatus

期刊：Virulence（Volume 12, Issue 1, Pages 818-834）

DOI：https://doi.org/10.1080/21505594.2021.1893945

研究背景与目的

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是导致人类和动物危及生命的侵袭性真菌感染最具致病性的真菌之一，尤其在免疫功能低下患者和囊性纤维化患者中危害严重。传统上，啮齿类动物模型是研究真菌感染发病机制的金标准，但国际3R原则（替代、减少、优化）鼓励研究人员寻找替代模型。

大蜡螟（Galleria mellonella）作为一种非哺乳动物微型宿主模型，近年来受到越来越多的关注。其幼虫具有与脊椎动物先天免疫系统高度相似的免疫防御机制，且能在18-37°C的宽温度范围内存活，使其成为研究人类病原体的理想选择。本文综述了大蜡螟在研究烟曲霉毒力因子中的应用，比较了不同实验方案，并总结了已测试的各类突变体及其对毒力的影响。

核心问题：大蜡螟能否作为可靠的预筛选模型，用于研究烟曲霉的毒力因子，从而减少哺乳动物实验的需求。

研究对象

宿主模型：大蜡螟末龄幼虫

病原体：烟曲霉野生型菌株及大量基因缺失突变体

突变体类型：涉及次生代谢、发育调控、铁代谢、应激反应等多个功能类别的遗传改造菌株

主要研究思路及结果

大蜡螟模型的关键优势与局限

大蜡螟幼虫作为感染模型具有突出优势：其拥有与脊椎动物先天免疫系统高度相似的细胞免疫和体液免疫机制，可在18–37°C范围内培养，尤其在37°C下能模拟哺乳动物体温环境；此外，它繁殖快、成本低、易于实验室大规模饲养，且已于2018年完成全基因组测序，为遗传学研究奠定了基础。目前PubMed上检索“Galleria mellonella”已发表科学论文超过2,200篇。

然而，该模型也存在主要局限性，实验结果的可重复性低于小鼠模型，易受幼虫来源、饲养条件、温度、营养、遗传背景等多种因素影响，并且缺乏适应性免疫系统，无法完全模拟哺乳动物复杂的宿主—病原体相互作用。

实验感染方案对比

体表涂抹法：模拟自然真菌感染途径，但可重复性差

强制饲喂法：将真菌悬液注入幼虫口器

注射接种法：最常用方法，将分生孢子悬液注入血体腔，可精确控制接种量

注射接种法（5-20 μL/幼虫）是最主流的方法，使用胰岛素注射器或Hamilton微量注射器。接种后幼虫在37°C、避光条件下培养，每日监测存活率（通常5-10天）。

发现各研究在幼虫选择标准、接种量和培养条件方面存在显著差异，这是导致结果可重复性问题的核心原因。推荐使用6龄幼虫（200-300mg）、Hamilton微量注射器接种10 μL分生孢子悬液（10⁴-10⁶/幼虫）、37°C避光培养、每日监测。

菌株来源与毒力关系

关于烟曲霉菌株来源与毒力之间的关系，现有研究结论并不一致，Alshareef等（n=30）发现临床分离株毒力高于环境分离株，而Cheema和Christians（各n=8）则观察到相反结果，环境株致死率更高；Knox等发现国际空间站分离株比临床参考株更致死。

本研究组首次测试了动物来源菌株，发现其毒力变异范围与临床和环境株相似。综上所述，目前尚无充分证据支持菌株来源与毒力之间的明确关联，同一来源内的菌株间变异同样显著。

毒力因子突变体筛选结果

次生代谢、发育调控和铁代谢三类突变体在大蜡螟中呈现不同毒力表型，黑色素缺陷和部分septin/RGS突变体表现为高毒力，多数铁载体和营养代谢突变体为低毒力或无毒力。模型一致性对比显示，铁代谢突变体在两模型中高度一致，但约半数突变体趋势相同，存在个别不一致案例。

结论：大蜡螟适用于大规模预筛选，关键发现仍需小鼠验证，缺乏适应性免疫是差异主因。

组织病理学发现

通过Gomori-Grocott染色和组织切片分析，研究揭示了烟曲霉在幼虫体内的感染进程，感染后2小时，血细胞中hemocyte密度迅速增加，启动吞噬反应；感染后3天，出现黑色素化结节，内含分生孢子和菌丝，类似哺乳动物肉芽肿结构；感染后7天，结节数量和大小显著增加，分布于幼虫全身，菌丝广泛侵袭。此外，烟曲霉还通过fumagillin和gliotoxin等毒素抑制hemocyte功能，帮助真菌逃避免疫清除，实现免疫逃逸。

文章结论

大蜡螟幼虫模型凭借其成本低、操作简便、可在哺乳动物体温下培养、先天免疫系统与人类高度保守等优势，已成为研究烟曲霉毒力因子的有力预筛选工具。文章系统汇总了超过60种烟曲霉突变体在大蜡螟中的毒力数据，涵盖次生代谢、营养代谢等多个关键信号通路，其中铁代谢通路的研究在大蜡螟和哺乳动物模型中表现出高度一致性，充分验证了该模型的可信度。尽管存在约50%的模型间一致性，大蜡螟仍完美符合3R原则，可用于大规模初筛，减少哺乳动物实验数量，再对关键发现进行小鼠验证。总之大蜡螟是一个快速、低成本、高通量的毒力因子预筛选平台，也是符合伦理的哺乳动物实验替代方案。

参考文献

[1] Durieux M F, Melloul É, Jemel S, et al. Galleria mellonellaas a screening tool to study virulence factors of Aspergillus fumigatus[J]. Virulence, 2021, 12(1): 818–834.

[2] Slater J L, Gregson L, Denning D W, et al. Pathogenicity of Aspergillus fumigatusmutants assessed in Galleria mellonellamatches that in mice[J]. Medical Mycology, 2011, 49(Suppl 1): S107–S113.

[3] Reeves E P, Messina C G M, Doyle S, et al. Correlation between gliotoxin production and virulence of Aspergillus fumigatusin Galleria mellonella[J]. Mycopathologia, 2004, 158(1): 73–79.

[4] Fallon J P, Reeves E P, Kavanagh K. The Aspergillus fumigatustoxin fumagillin suppresses the immune response of Galleria mellonellalarvae by inhibiting the action of haemocytes[J]. Microbiology, 2011, 157(Pt 5): 1481–1488.

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