低聚半乳糖与罗伊氏乳酸杆菌协同富集产酸拟杆菌合成十五烷酸缓解肠道炎症与屏障损伤

文章简介

英文题目：Galactooligosaccharides and Limosilactobacillus reuteri synergistically alleviate gut inflammation and barrier dysfunction by enriching Bacteroides acidifaciens for pentadecanoic acid biosynthesis

中文题目：低聚半乳糖与罗伊氏乳酸杆菌协同富集产酸拟杆菌合成十五烷酸缓解肠道炎症与屏障损伤

期刊名：Nature Communications

发表年份：2024

IF：14.7

发表单位：中国农业大学

DOI号：10.1038/s41467-024-53144-1 微生物多样性+宏基因组+细菌基因组完成图+真核转录组

样品来源：粪便、结肠组织

文章摘要
溃疡性结肠炎（UC）是一种使人衰弱的炎症性肠病，其特征是肠道炎症、屏障功能障碍和生态失调，可用的治疗选择有限。本研究系统地研究了由低聚半乳糖（GOS）和罗伊氏乳杆菌组成的合生素在结肠炎小鼠模型中的治疗潜力，揭示了GOS和罗伊氏乳杆菌通过促进产酸拟杆菌合成十五烷酸（一种奇链脂肪酸），协同保护肠道炎症和屏障功能障碍。值得注意的是，合生素、B.acidfaciens和十五烷酸均能通过抑制NF-κB活化来抑制肠道炎症和增强紧密连接。此外，在人类UC患者和脂多糖诱导的猪肠道炎症的粪便中，也观察到产酸拟杆菌和十五烷酸水平的类似降低。该研究结果阐明了合生素的保护机制，并强调了其与B.acidfaciens和十五烷酸一起治疗UC和其他肠道炎症性疾病的潜力。

主要研究结果
1、GOS和罗伊氏乳杆菌组成的合生素在改善肠道炎症和屏障功能障碍方面非常有效，同时丰富了产酸拟杆菌的丰度

罗伊氏乳杆菌可以利用GOS作为唯一的碳源，表明罗伊氏乳杆菌与GOS9之间存在协同作用。为了研究由GOS和罗伊氏乳杆菌组成的合成素对肠道炎症和屏障功能的影响，作者给小鼠单独或联合给药GOS和罗伊氏乳杆菌四周，然后再给DSS处理一周（图1a）。结果表明，合成素显著逆转了体重减轻（图1b）和结肠缩短（图1c），同时保持了结肠粘膜的完整性（图1d）。此外，该合成素显著减轻了肠道损伤（图1e），逆转了DSS诱导的紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1的抑制（图1f），并通过降低促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6来减轻肠道炎症（图1g）。

DSS引起了结肠微生物群组成的明显变化，合成素导致了进一步的改变，而不会使其恢复正常（图1）。更仔细的检查显示，DSS引起健康小鼠结肠中拟杆菌的急剧减少，而合成素处理的小鼠中恢复了拟杆菌（图1i，j）。此外，产酸拟杆菌和解木聚糖芽孢杆菌在拟杆菌属物种中特异性富集。相比之下，GOS或单独罗伊氏乳杆菌无法在DSS处理的小鼠中富集产酸拟杆菌（图1k）。宏基因组测序进一步证实了合成素干预后产酸拟杆菌相对丰度的增加。

为了进一步确定合成素特异性产生的关键代谢物是产酸拟杆菌富集的原因，作者检测了分别给予GOS、罗伊氏乳杆菌和合成素的DSS处理小鼠粪便中代谢物的差异。作者的研究结果显示，β-丙氨酸、n -乙酰- d -葡萄糖胺、4-甲基己酸、C15:0和肉豆粕酸是合成素组中显著富集的前五种代谢物。为了确定哪些代谢物优先支持产酸拟杆菌的生长，作者将小鼠盲肠微生物群与GOS、罗伊氏乳杆菌、共生菌或每种差异富集的代谢物进行厌氧培养。结果显示，只有n -乙酰- d -氨基葡萄糖能显著提高培养基中产酸拟杆菌的相对丰度，接近合成菌的效果。此外，当替换葡萄糖时，n -乙酰- d -氨基葡萄糖特异性地促进了产酸拟杆菌的生长。综上所述，n -乙酰- d -氨基葡萄糖是合成素的主要代谢物，负责酸化杆菌的富集。

图1 合成素能有效改善肠道炎症和屏障功能障碍，丰富促酸拟杆菌

2、产酸拟杆菌在接种合成素补充来源小鼠微生物群的FMT小鼠中富集

为了评估来自合成素补充小鼠的粪便微生物群是否能够减轻肠道炎症和屏障功能障碍，对肠道微生物群耗尽的受体小鼠进行了FMT（图2a）。合成素来源的微生物群，有效地减轻了DSS处理小鼠的体重减轻（图2b）、结肠长度（图2c）和肠粘膜表面损伤（图2d，e）。此外，DSS处理小鼠的血清促炎细胞因子水平，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，在对合成素的反应中被显著抑制（图2f），紧密连接蛋白，如Claudin-1和Occludin的表达也被显著恢复（图2g）。此外，FMT改变了受体小鼠的粪便微生物群结构（图2h）。在属水平上，拟杆菌和乳杆菌在接受合成素来源微生物群的小鼠中都增加了（图2i，j）。在种水平上，产酸拟杆菌在FMT后成功定植在肠道中，而不是解木聚糖芽孢杆菌（图2k），这表明产酸拟杆菌可能在保护DSS处理小鼠免受肠道炎症和屏障功能障碍方面具有潜在的重要作用。

图2 产酸拟杆菌在dss处理的小鼠中富集

3、产酸拟杆菌可以防止肠道炎症和屏障功能障碍

为了直接评估产酸拟杆菌对肠道炎症和屏障功能障碍的保护作用，作者将产酸拟杆菌接种于小鼠两周，然后给予一周的DSS处理以诱导结肠炎（图3a）。产酸拟杆菌可显著减轻DSS引起的肠道损伤，如体重减轻、结肠长度、肠道形态和组织学损伤评分（图3b-e）。口服产酸拟杆菌也能部分恢复紧密连接的蛋白表达（图3f），抑制促炎细胞因子的蛋白表达（图3g）。这些结果证实了GOS和罗伊氏乳杆菌富集的增酸芽胞杆菌对肠道炎症和屏障功能障碍具有保护作用。

图3 产酸拟杆菌防止肠道炎症和屏障功能障碍

4、GOS和罗伊氏乳杆菌合成素可促进十五烷酸（C15:0）的合成，减轻肠道炎症和屏障功能障碍

为了探索合成素产生的代谢物在恢复肠道屏障功能障碍中的保护作用，从喂食标准食物或添加合成物的小鼠粪便中制备无细菌细胞的上清，然后口服给药给DSS治疗的小鼠（图4a）。结果显示，从添加了合成物的小鼠身上提取的上清液，显著逆转了DSS处理小鼠的体重减轻（图4b）。结肠长度（图4c）、粘膜完整性（图4d）、组织学损伤评分（图4e）、杯状细胞数量（图4f）、紧密连接蛋白表达（图4g）和血清促炎细胞因子水平（图4h）也通过合成素来源的肠道上清得到恢复，提示肠道代谢产物的产生响应于合成给药有助于减轻肠道炎症和屏障功能障碍。

图4 添加合成素的小鼠粪上清可减轻肠道炎症和屏障功能障碍

为了确定可能与疾病缓解有关的代谢物，作者对DSS处理小鼠的粪便无细菌细胞上清液进行了靶向代谢组学研究。从306种不同类别的代表性代谢物中，共发现35种代谢物对GOS和/或罗伊氏乳杆菌的反应存在差异富集（图5a）。其中，十五烷酸（C15:0）在DSS处理后下调最为显著，而在合成素给药后上调。另外也发现，合成素给药DSS处理后小鼠粪便中的C15:0升高（图5d）。有趣的是，9-pentadecanoic acid，一种较少的C15:0异构体，也同样随着合成素的增加而增加（图5e）。与此一致的是，用粪便微生物群（图5f）、粪便无细菌细胞上清（图5g）或产酸拟杆菌（图5h）移植的DSS处理小鼠的粪便中C15:0的浓度也增加了。这些结果共同表明，C15:0可能是合成素产生的关键代谢物，并负责减轻肠道炎症和屏障功能障碍。

图5 GOS和罗伊氏乳杆菌合成素可丰富小鼠体内的十五烷酸（C15:0）

5、产酸拟杆菌合成十五烷酸（C15:0），防止肠道炎症和屏障功能障碍

为了确定产酸拟杆菌是否能直接合成C15:0，作者分别在GOS和罗伊氏乳杆菌存在下或联合培养产酸拟杆菌。在产酸拟杆菌的培养上清中观察到C15:0升高，重要的是，GOS和罗伊氏乳杆菌与酸化芽孢杆菌共培养时，C15:0的量明显增加，而单独使用任何一种都只有边际效应（图6a）。为了直接确认产酸拟杆菌是否具有合成C15:0的能力，作者对产酸拟杆菌进行了全基因组测序，发现其编码39个脂质代谢相关基因。值得注意的是，生物合成C15:0的所有关键基因都存在（图6b），这表明产酸拟杆菌是一种产生C15:0的细菌。

图6 产酸拟杆菌合成十五烷酸（C15:0）

为了进一步研究这些主要的C15:0合成基因是如何在合成素补充的小鼠中被调节的，作者进行了宏基因组测序，发现DSS下调了fabK、acrC、fabF和FATA四个基因，但在合成素补充后恢复了这些基因（图6c），这表明GOS和罗伊氏杆菌的结合可能通过富集产酸拟杆菌来加速C15:0的生物合成。事实上，在所有差异富集的脂肪酸中，只有C15:0与添加了合成素的DSS处理小鼠的产酸拟杆菌呈显著正相关（图6d）。此外，受体小鼠的粪便中C15:0的浓度与添加了合成菌的小鼠的粪便微生物群（图6e）或直接添加了酸化芽孢杆菌（图6f）的粪便中C15:0的浓度呈正相关。综上所述，C15:0是产酸拟杆菌合成的代谢物，可能参与了DSS诱导小鼠肠道损伤的保护。

6、十五烷酸（C15:0）通过激活FATP4和抑制NF-κB激活来改善肠道炎症和屏障功能障碍

为了直接验证产酸拟杆菌衍生的C15:0对肠道屏障功能障碍的保护作用，作者每天给小鼠口服C15:0，持续三周，然后再用DSS处理一周（图7a）。结果显示，C15:0显著减轻了体重减轻（图7b）和结肠损伤（图7c-f），上调了紧密连接蛋白表达（图7g），抑制了促炎细胞因子mRNA表达（图7h）。此外，在小鼠MODE-K细胞（图7i-k）和人Caco-2细胞中，C15:0恢复了紧密连接蛋白的表达，并显著下调了LPS诱导的促炎细胞因子的表达，这表明C15:0具有广泛的抗炎作用，并通过抑制炎症细胞因子的合成来保护屏障功能。

图7 十五烷酸（C15:0）通过改善屏障功能和抑制炎症反应来促进肠道健康

为了进一步揭示C15:0介导的肠屏障完整性保护的潜在机制，作者对C15:0或不给药的DSS处理小鼠的结肠组织进行了RNA测序（图8a）。结果显示，C15:0抑制多种炎症相关通路（图8b）。。另外，C15:0抑制了DSS处理小鼠（图8c）和LPS诱导的MODE-K细胞（图8d）的NF-κB活化，NF-κB p65磷酸化降低证明了这一点。与此一致的是，在给予合成素（图8e）、粪便微生物群（图8f）、粪便细菌无细胞上清（图8g）或产酸拟杆菌（图8h）的DSS处理小鼠中，NF-κB p65的磷酸化也降低了。

图8产酸拟杆菌衍生的十五烷酸（C15:0）抑制NF-κB的激活

此外，脂肪酸转运蛋白4 (FATP4/Slc27a4)，一种主要的长链脂肪酸转运蛋白和脂肪酰基辅酶a合成酶，在DSS处理的小鼠，LPS诱导的人Caco-2细胞和小鼠MODE-K细胞的结肠中被抑制，但在C15:0给药后基本恢复。此外，在脂多糖处理的MODE-K细胞中，C15:0介导的紧密连接蛋白表达的恢复和促炎细胞因子的抑制被FATP4抑制剂显著逆转。这些结果表明，C15:0的抗炎和屏障保护作用是通过FATP4和抑制NF-κB活化介导的。

7、产酸拟杆菌和十五烷酸在UC患者和LPS刺激仔猪中下调

作者观察到DSS处理小鼠的产酸拟杆菌和C15:0水平显著下降，GOS和罗伊氏乳杆菌使其恢复。为了证实研究结果在其他肠道炎症性疾病中的临床相关性，作者2023年在南通大学附属江阴市人民医院入院的15名健康供体和11名UC患者中初步检测了产酸拟杆菌的相对丰度。RT-qPCR显示，与健康个体相比，UC患者粪便中的产酸拟杆菌显著减少（图9a）。UC患者的C15:0浓度也显著降低（图9b）。此外，粪便中C15:0的浓度与UC和健康个体粪便中产酸拟杆菌的丰度呈正相关（图9c）。同样地，LPS刺激在仔猪中引起了明显的肠道炎症（图S9），与粪便中产酸拟杆菌（图9d）和C15:0水平（图9e）的显著降低有关。在LPS诱导的猪中，产酸拟杆菌与C15:0之间也观察到强烈的正相关（图9f）。

图9 产酸拟杆菌十五烷酸在UC患者和LPS诱导的仔猪中下调

为了进一步验证上述的结果，作者检索并分析了几个公开的代谢组学数据集中的C15:0浓度，这些数据集涉及来自中国、美国、荷兰和挪威的503名健康对照者和649名UC患者。UC患者粪便（图9g）、血清（图9h）和结肠活检（图9i）中的C15:0浓度均明显低于健康志愿者。此外，与非活动性UC患者相比，活动性UC患者粪便（图9j）、血清（图9k）和结肠活检（图9l）中的C15:0浓度显著降低。这些结果共同表明，在不同动物物种的不同肠道炎症模型中，炎症和屏障功能障碍与产酸拟杆菌和C15:0水平的降低相关。GOS和罗伊氏乳杆菌合成素可能具有治疗UC的潜力。此外，给药产酸拟杆菌或C15:0也可能有希望治疗UC和其他肠道炎症性疾病。

结论
总的来说，本研究结果表明，GOS和罗伊氏乳杆菌的合成组合通过促进产酸拟杆菌合成十五烷酸（C15:0）来保护肠道炎症和屏障功能障碍。这种合成素、共生菌和细菌代谢物之间的关键联系为UC和其他肠道炎症性疾病提供了证据和潜在的治疗途径。