头孢他啶是VIM型碳青霉烯酶多样化和选择驱动的关键因素

文章题目：Ceftazidime Is the Key Diversification and Selection Driver of VIM-Type Carbapenemases

文章链接：doi: 10.1128/mBio.02109-17

发表时间：2018.5

发表期刊：mBio

IF：6.4

研究背景：耐碳青霉烯类药物的多种革兰氏阴性菌已成为影响国际公共卫生安全的重要因素。一些作者认为碳青霉烯类药物的临床使用并不是某些碳青霉烯酶进化的原因。比如在D类酶中，系统发育重建表明，新识别的OXA变体是祖先变体，可能在亚胺培南商业化使用之前就存在于细菌中。另一方面，在最流行的A类和B类碳青霉烯酶（KPC和VIM）中，对新变体的描述是最近出现的现象，这可能表明环境压力促使了更有效的变体出现。本研究的主要目的是分析导致VIM碳青霉烯酶多样化发展的选择抗生素，从遗传学、生物信息学和进化生物学的综合角度研究氧亚胺类头孢菌素的作用，特别是分析头孢他啶，在β-内酰胺酶多样化中的作用是否可能构成一种普遍现象。

研究对象：bla_VIM核苷酸序列（包含49种VIM类型，VIM-1至VIM-54）

研究方法：系统发育分析、选择压力分析（dN/dS）、定点诱变实验、转化实验、抗生素压力下的连续传代实验、抗菌药物敏感性检测。

主要研究内容及结果：

1. 1、系统发育分析

作者使用BLAST从GenBank获得所有可用的bla_VIM核苷酸序列。除存在gaps和recombinant的序列外，其余序列均被用于构建系统发育树（57 / 438），其中包括49种VIM类型（VIM-1至VIM-54）。

最大似然树（ML）结果显示VIM可以分为四个系统发育群，它们分别以VIM-2、VIM-4/VIM-1、VIM-5和VIM-13为代表。此外，在分析的所有VIM变异体中，检测到两个重组变异体：① bla_VIM-12，由bla_VIM-1和bla_VIM-2重组产生；② bla_VIM-25，由bla_VIM-5和bla_VIM-2的重组产生。

利用Network软件进行的祖先重建显示，bla_VIM-2、bla_VIM-4和bla_VIM-1节点的分化主要由单个非同义突变所引起。在bla_VIM-2系统发育群中，大部分新变体直接来自于bla_VIM-2。而对于bla_VIM-4/ bla_VIM-1，推断为2次分化事件，bla_VIM-1也由bla_VIM-4分化而来。

这些结果表明，尽管bla_VIM的祖先可能起源于很久以前，但其多样化的产生过程是最近才出现的，而且是在加速发展中的。

为了进一步评估VIM变体的分化过程，作者进行了BEAST系统发育分析（分歧时间估算）和贝叶斯天际线图分析（群体历史动态推断）。其结果表明bla_VIM-2和bla_VIM-4的分化分别发生在1987年和1989年左右，而bla_VIM-4的第二次多样化事件bla_VIM-1变体的发生在1994年左右。从bla_VIM-4到bla_VIM-1的进化方向性得到简约法的支持，并在后续头孢他啶压力的实验进化分析中得到证实。

1. 2、正选择突变、诱变及药敏试验

作者基于BEAST 1.8软件推断bla_VIM基因可能的正选择位点（ω=dN/dS>1）。根据cumulative posterior density（CPD）的评估又分为了高证据、中证据和低证据三档。然后通过定点诱变技术分别构建bla_VIM-2、bla_VIM-4和bla_VIM-1的单突变、双突变和三重突变体。总共构建了44个bla_VIM基因变体，21个来自bla_VIM-2，23个来自bla_VIM-4/bla_VIM-1。其两者各有9种变体已在自然界中被描述过。

bla_VIM基因的三重突变选择构建的是自然界中唯一被报道过的VIM-29（衍生自VIM-4），涉及R228S, H252R和N215K突变。此外，额外构建了类似的突变组合（R228S、H252R、Y218F以及R228L、H252R、Y218F），用以观察这种相似的突变是否能够提供类似VIM-29的适应性优势。

bla_VIM-2基因变体

在第一轮定点诱变，bla_VIM-2引入单突变时，几乎所有突变体中只有头孢他啶的MIC显著增加。那些突变位点被认为是正选择突变的突变体（高证据），其头孢他啶的MIC增加幅度最大。而碳青霉烯类的MIC值几乎没有增加甚至还出现了下降，尤其是厄他培南。药敏结果显示头孢他啶与厄他培南或哌拉西林-他唑巴坦的MIC之间存在拮抗效应，且这种变化在发生R228L突变时作用最为强烈，此时的头孢他啶MIC最高，厄他培南MIC最低。

在第二轮定点诱变时，R228S和R228L双突变的构建体表现出非常不同的结果，发生R228S的突变体对所有β-内酰胺类抗生素的MIC均产生负作用。而发生R228L的4个双突变体对头孢他啶的MIC升高。

此外，上述与VIM-29相似的突变组合均显示对所有β-内酰胺类抗生素的MIC持续降低。

1. bla_VIM-4基因变体

采用类似的方法对bla_VIM-4基因变体进行测试，与VIM-2类似，头孢他啶仍然时MIC受影响最严重的抗生素之一，特别是发生R228S和H224L的突变体。同时bla_VIM-4变体的头孢他啶与厄他培南或哌拉西林-他唑巴坦也存在多效拮抗作用。

VIM-29，与VIM-4相比表现为R228S, N215K和H252R的三重突变，其中R228S和N215K分别对应于VIM-1和VIM-19，且自然界中没有描述过单个H252R突变，这表明最初的分化事件可能与头孢菌素类药物更相关而不是碳青霉烯类药物。

1. 进化实验

作者进一步通过添加抗生素对连续传代的VIM携带菌株施加生存压力，分析碳青霉烯类（亚胺培南）和广谱头孢菌素（头孢噻肟）是否对对VIM进化有相似性的影响。结果于VIM-2和VIM-4而言，亚胺培南和头孢噻肟都未产生比野生型水解活性更高的VIM-2和VIM-4变体，而头孢他啶产生了多种不同的突变体。

文章结论

1、bla_VIM核苷酸序列的系统发育重建表明，目前的VIM家族分为四个系统群。

2、氧亚胺类头孢菌素，尤其是头孢他啶，其MIC受VIM突变引入的影响最大。

3、VIM突变正选择位点在头孢他啶和碳青霉烯类（尤其是厄他培南）之间，以及头孢他啶和哌拉西林-他唑巴坦之间均表现出多效拮抗作用。

参考文献

Martinez-Garcia L, Gonzalez-Alba J M, Baquero F, et al. Ceftazidime Is the Key Diversification and Selection Driver of VIM-Type Carbapenemases [J]. mBio, 2018, 9(3).

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