首次在实验室成功构建：一株兼具耐药与高毒力的“超级肺克”

肺炎克雷伯菌是医院感染的重要病原菌，近年来逐渐分化出两条令人担忧的进化路线：一条是耐碳青霉烯的菌株（CRKP），对多种抗生素高度耐受；另一条是高毒力菌株（HvKP），侵袭性强，可导致健康人群发生严重感染。学术界一直关注一个问题：如果这两类菌株通过基因水平转移交换各自的“技能”，是否会催生出兼具耐药性与高毒力的“超级菌株”（CR-hvKP）？最近，《中华医院感染学杂志》发表了一项研究，在实验室条件下成功实现了这一基因组合，并对所得菌株的毒力进行了验证。

文章信息

题名：肺炎克雷伯菌耐药基因和毒力基因传播机制

作者：贾阿韶，范晓怡，刘菊珍，黄云祖，赵径玄，余广超（通讯作者）

期刊：中华医院感染学杂志

年份/卷期/页码：2025，35(16)：2441-2444

DOI：10.11816/cn.ni.2025-246975

关键词：肺炎克雷伯菌；毒力基因；耐药基因；质粒接合；水平基因转移

一、研究背景与目的

肺炎克雷伯菌引起的感染包括肺炎、肝脓肿、尿路感染和败血症，在院内感染中占有重要地位。然而，碳青霉烯类抗生素作为治疗重症感染的最后防线，其对CRKP的疗效正在下降。与此同时，HvKP虽然通常对抗生素敏感，但其高毒力特性使其能够在免疫功能正常的个体中引发侵袭性疾病。若CRKP与HvKP通过质粒接合实现耐药基因与毒力基因的共传播，所形成的CR-hvKP将兼具耐药性和高侵袭性，临床治疗将极为困难。尽管目前自然界中CR-hvKP的报道尚属零星，但其潜在风险不可忽视。

本研究旨在回答三个问题：CRKP的耐药基因能否稳定传递给其他细菌？能否进一步传递给HvKP，形成双表型菌株？所形成的菌株毒力究竟有多强？

二、实验设计

研究使用的菌株来源于暨南大学附属第一医院2017年至2021年间保存的临床分离株。实验分为四个步骤。

首先，对现有菌株进行筛查，以确认是否存在天然形成的CR-hvKP。通过拉丝实验联合聚合酶链式反应检测毒力基因，同时对CRKP菌株进行毒力基因筛查，对HvKP菌株进行碳青霉烯酶基因筛查。

其次，验证耐药基因的水平转移能力。选取一株同时携带VIM和KPC耐药基因的CRKP作为供体菌，另选四株已知具有接合能力的IMP型CRKP作为对照，以大肠杆菌J53为受体菌。将供体与受体共培养后，使用含有美罗培南的选择性培养基筛选接合成功的菌株。

第三步，进行CRKP与HvKP之间的接合实验。将五株经上述实验证实具有耐药基因传播能力的CRKP与五十株HvKP进行两两配对，共计二百五十组接合组合。同样使用含美罗培南的培养基筛选，并通过PCR确认接合菌是否同时携带耐药基因和毒力基因。

第四步，利用大蜡螟幼虫感染模型评估接合菌的毒力。大蜡螟可在37摄氏度下培养，其先天免疫通路与哺乳动物具有一定同源性，是毒力预筛选的常用替代模型。将接合菌注射入幼虫体内，观察二十四至七十二小时的存活情况。

三、主要结果

自然菌株筛查结果显示，CRKP组中有三株拉丝试验阳性，但毒力基因检测均为阴性；五十株HvKP中未检出碳青霉烯酶基因。这表明在本研究所用的临床保存菌株中，不存在天然形成的CR-hvKP。

耐药基因转移实验中，供体CRKP携带的KPC基因成功转移至大肠杆菌J53，而VIM基因未能转移。四株IMP型CRKP均能将耐药基因转移至J53。据此筛选出五株具有介导耐药基因传播能力的CRKP菌株。

在CRKP与HvKP的接合实验中，二百五十组配对仅有一组获得成功。该成功组合中，供体菌为携带blaIMP-4的CRKP，受体菌为一株HvKP。接合菌同时携带毒力基因（aerobactin、RmpA）和耐药基因（blaIMP-4），且拉丝试验阳性，呈现高黏液表型。这意味着该菌株在保留高毒力特性的同时获得了耐药性。

大蜡螟感染实验结果显示，注射该接合菌的幼虫在二十四小时内全部死亡，证实其具有高致死性。

四、机制分析

CR-hvKP的形成依赖于质粒介导的水平基因转移。目前学界认为主要有三条途径：一是HvKP从其他细菌获得耐药质粒，从而同时具备毒力和耐药性；二是CRKP获得毒力质粒，成为耐药且高毒力的菌株；三是耐药质粒与毒力质粒融合为一个新的杂合质粒，同时携带两类基因。本研究观察到的现象更接近前两种途径，即耐药质粒成功转入HvKP，实现双表型共存。

自然界中CR-hvKP之所以少见，可能与以下因素有关：毒力质粒和耐药质粒通常体积较大，在同一菌株内共存的物理空间有限；多数质粒属于非接合型，转移效率较低；部分质粒需要辅助质粒的动员才能实现转移。因此，CR-hvKP的形成并非高频事件，但一旦形成，其临床危害极大。

五、大蜡螟模型的作用

大蜡螟模型在本研究中承担了关键的毒力验证功能。其作用体现在三个方面。第一，区分表型毒力与真实毒力。拉丝试验阳性或毒力基因PCR阳性并不能完全等同于菌株的实际致病能力，活体感染实验是更为可靠的评判标准。第二，降低实验成本与伦理负担。相较于小鼠模型，大蜡螟易于饲养、通量高、伦理限制少，适合大规模初步筛选。第三，复现感染过程中的关键生物学特征。已有研究表明，大蜡螟模型能够再现肺炎克雷伯菌在宿主体内的复制、免疫逃逸等过程，其结果与小鼠肺炎模型具有良好的一致性。

当然，该模型也存在固有局限。大蜡螟仅具备先天免疫系统，缺乏适应性免疫，因此无法用于研究获得性免疫相关的致病机制。此外，由于进化距离较远，某些宿主特异性现象可能无法在该模型中体现。因此，大蜡螟更适合作为发现工具，最终结论仍需在哺乳动物模型中验证。

六、对检验、临床与院感工作的启示

对于检验科而言，不应仅满足于报告耐药表型。当检出CRKP时，建议增加拉丝试验进行初筛，有条件时可进一步检测毒力基因。若发现同时具备耐药和高毒力特征的菌株，应妥善保存并及时预警。

对于临床医生而言，早期隔离优于事后抢救。多重耐药菌感染患者应在两小时内落实隔离医嘱，HvKP与CRKP患者应尽量避免安置于同一病区。免疫功能低下及基础疾病较多的患者属于高危人群，需格外关注。

对于院感管理部门而言，监控视角应从菌株层面拓展至基因层面。传统的感控措施聚焦于手卫生、环境消毒和患者隔离，而耐药质粒与毒力质粒在病区内的水平传播同样值得警惕。CR-hvKP不一定是从外部输入的，也可能是在院内环境中逐步组装而成。

七、研究局限与未来方向

本研究存在若干局限性。接合实验在体外条件下完成，未在动物体内验证实际传播概率。基因检测仅覆盖了部分耐药和毒力标志物，未进行全基因组测序，因此无法解析质粒的完整结构。此外，菌株来源为单中心历史保存样本，样本量有限，代表性不足。

未来的研究方向包括：对成功接合的菌株进行全基因组测序，明确其质粒架构；在小鼠模型中复现该菌株的致病过程；开展多中心联合筛查，建立CR-hvKP的早期预警体系。

结语

这项研究的核心价值不在于“人工制造超级菌”，而在于揭示了耐药性与高毒力可以通过质粒接合实现跨菌株传播。实验室中二百五十组配对仅成功一组，看似概率极低。但在医院环境中，每天都有大量的细菌共存于同一病区，基因水平转移的机会远多于实验室条件。每一次成功的质粒转移，都有可能成为一次暴发事件的起点。尽早识别、及时干预，是防止CR-hvKP从实验室走向临床的关键。

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Q2：想确认菌株是不是“耐药+高毒力”双表型，需要做什么检测？

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Q3：质粒接合和水平基因转移机制，能进一步解析吗？

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Q4：只有临床分离株，没有突变体或标准株，能直接开工吗？

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