【Nat Commun】山西医科大学张克让教授团队成果，肠道微生物群在炎症性抑郁症中的免疫调节作用

导读

重度抑郁症（MDD）具有高度异质性和潜在病因的复杂性，在预防和治疗上面临重大挑战。1995年首次提出抑郁症的神经免疫假说，既往研究表明炎症在MDD的病因学和病理生理学中发挥重要的作用。该类型的抑郁症与增加的促炎细胞因子有关，如白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、c反应蛋白（CRP）等，这些炎症因子有助于区分炎症性和非炎症性抑郁症。综合各种炎症指标的稳定性、准确性和可用性，美国疾病控制和预防中心和美国心脏协会（CDC/AHA）推荐CRP作为临床和公共卫生中的炎症标志物，低风险（<1.0 mg/L）、平均风险（1.0-3.0 mg/L）和高风险（>3.0 mg/L）。而CRP浓度（>3.0 mg/L）已被用作炎症性抑郁症独特的临床和生物学特征。此外，炎症性抑郁症患者可能代表相对耐药的人群，这一亚群患者的治疗尤其具有挑战性。例如，MDD中炎症的存在与一线抗抑郁治疗的反应较差有关。因此，探索炎症性抑郁症的确切起源及其致病机制以开发更有效的治疗方法至关重要。

肠道微生物群可以直接调节免疫系统，帮助维持和破坏免疫耐受。在生态失调过程中表达的微生物相关分子MAMPs被宿主识别受体识别，如NLRP3炎症小体。这些受体是进入先天免疫系统的门户，也是导致细胞因子产生级联反应的第一步。这些细胞因子增加了肠道的通透性，并破坏了血脑屏障（BBB）。还可以激活中枢神经系统（CNS）中的小胶质细胞，导致促炎细胞因子的分泌，从而改变大脑的结构和功能，进一步导致临床抑郁症。肠道微生物群可以产生一系列有益的代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs），可以影响免疫和炎症反应。SCFAs可通过穿过血脑屏障调节脑功能，影响肠黏膜免疫和中枢神经系统免疫系统。因此，肠道微生物群可能通过调节外周和中枢免疫系统来影响抑郁症状。有研究探索MDD中的“微生物-免疫-脑轴”假说，但由于抑郁症的高异质性，得出的结果并不一致。

因此，有必要通过考虑抑郁症的炎症性亚型来阐明这一假设。到目前为止，肠道微生物群的特征及其免疫调节在炎症性抑郁症中的作用仍不确定。

针对以上科学问题，2024年4月8日，山西医科大学第一医院精神卫生科张克让教授团队在【Nature Communications】杂志上发表题为“Immunoregulatory role of the gut microbiota in inflammatory depression”的研究成果，使用人和小鼠样本进行实验，首次揭示了炎性抑郁症患者的肠道菌群特征及其免疫调控机制。本研究中刘鹏鸿副教授和刘志芬主任医师为本文共同第一作者，张克让教授和孙宁副教授为本文共同通讯作者。

方案设计&流程

1. 一、人群样本研究
2. 1、收集85例MDD患者和85例正常对照的粪便、血浆样本。其中粪便样本做16s扩增子测序，血浆样本做靶向SCFA检测和ELISA检测验证指标。
3. 2、根据hs-crp浓度，将85例MDD患者分为炎症性抑郁症42例，非炎症性抑郁症43例。从炎症性抑郁症和正常对照各选择20例样本进行宏基因组测序。
4. 3、MDD和HC组各6个样本进行80种炎症蛋白芯片检测和炎症因子以及通透性生物标志物的ELISA检测。
6. 二、小鼠实验研究
7. 1、从炎症性MDD和非炎症性MDD以及HC组随机各选择10个人作为粪菌移植的供体，进行粪菌移植实验造模。高炎症组20只小鼠，低炎症组8只小鼠，HC组7只小鼠，空白组9只小鼠。进行行为学实验并记录体重变化。
8. 2、小鼠结肠内容物16s扩增子测序检测粪菌移植定制情况。
9. 3、小鼠血清ELISA检测，结肠组织QPCR定量检测TLR-4,NLRP3表达，免疫组化。
10. 4、小鼠大脑海马区TLR-4，NF-κB，NLRP3，Caspase-1和IL-1β的QPCR定量检测，免疫荧光检测海马区小胶质细胞数量和形态。
11. 5、益生菌CB干预高炎症组小鼠进行挽救实验。

主要内容&结果

一、临床研究部分

1. MDD和HC的临床特征、炎症因子和SCFAs分布组成

MDD和HC组的年龄、性别、体重指数（BMI）相似（P > 0.05）。队列中的人群没有其他身体状况、超重情况。MDD组的受教育年限明显少于HC组（P < 0.001）。MDD组的汉密尔顿抑郁量表（HAMD-17）和汉密尔顿焦虑量表（HAMA）得分高于HC组（P < 0.001）。MDD组hs-CRP水平高于HC组（P＜0.05）；而IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α浓度在两组间没有显著差异（P>0.05）。MDD组丙酸和丁酸水平明显低于HC组（P＜0.05）。但两组之间的乙酸、异丁酸、戊酸和己酸水平类似（P>0.05）。

2. MDD与HC之间的肠道微生物群特征

α多样性分析显示，MDD组的Chao指数，Faith的系统发育多样性（PD）和观察到的物种数量均高于HC组。然而，MDD患者的Good覆盖率较低（P＜0.05）。Beta多样性分析表明，组间的差异大于组内的差异。采用LEfSe分析来调查MDD组和HC组之间的微生物群差异。在科水平上，MDD组的微单孢子菌科和红螺旋菌科的相对丰度升高，而梭状芽孢杆菌科、胃链球菌科、巴氏杆菌科和毛螺旋杆菌科在HC组相对丰度升高。在属水平上，MDD组的克氏菌的相对丰度显著较高；HC组的梭状芽孢杆菌、玫瑰杆菌、嗜血杆菌、SMB53和螺旋杆菌的相对丰度较高。

为阐明肠道微生物群、hs-CRP、SCFAs与抑郁症状之间的关系，通过相关分析发现所有受试者中梭状芽孢杆菌、玫瑰杆菌、嗜血杆菌、SMB53和螺旋杆菌的相对丰度与丙酸和丁酸呈正相关，与hs-CRP和HAMD-17总分呈负相关（P < 0.05）。hs-CRP水平也与HAMD-17和HAM-A总评分呈正相关（P<0.05）。

图1 MDD患者肠道微生物组成、短链脂肪酸（SCFAs）含量

3.MDD和HC组肠黏膜的炎症因子与通透性生物标志物

为探讨紊乱的肠道微生物群对肠道黏膜的影响，对12名受试者（MDD = 6，HC = 6）的肠道黏膜样本使用含有80种炎症蛋白的芯片进行检测。热图显示，一些参与炎症激活的细胞因子蛋白，如TNF-R1、TNF-R2、巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）和IL-12，均过表达。而生长激素（GH）、成纤维细胞生长因子4（FGF-4）、转化生长因子1β（TGF-1β）和血管内皮生长因子（EG-VEGF）均参与肠黏膜修复，在MDD组中表达不足。

为进一步阐明炎症途径和量化肠道通透性标志物，进行酶联免疫吸附试验（ELISA）。MDD组TLR-4、NF-κB、NLRP3水平升高（P<0.05）。渗透性生物标志物，如Claudin-1、ZO-1和Occludin的水平降低（P<0.05）；免疫组化证实了这一点。相关分析显示，梭状芽孢杆菌的相对丰度与MCSF、hs-CRP水平呈负相关，炎症因子与通透性生物标志物（Claudin-1、ZO-1、Occludin）和SCFAs（乙酸、丙酸、丁酸）呈负相关；与HAMD-17总分呈正相关。丁酸水平与Occludin呈正相关，与TLR-4、NF-κB、NLRP3、TNFR2、HAMD-17呈负相关。Claudin-1与肠黏膜修复标志物，如GH和EG-VEGF呈正相关。

图2 MDD（n=6）和HC（n=6）之间的肠黏膜炎症因子和通透性生物标志物的差异

4.炎症性抑制症中的肠道微生物群特征、肠粘膜炎症因子和通透性生物标志物

根据血浆hs-CRP水平，进一步将MDD患者分为炎症性抑郁组（=42）和非炎症性抑郁组（=43）。为明确炎症性抑制患者中肠道微生物群的特征，对三组样本进行了LEfSe分析。与非炎症性抑制和HC相比，拟杆菌科和拟杆菌科等促炎细菌的相对丰度明显较高；炎症性抑郁症组中可产生短链脂肪酸的梭菌科、梭菌科等抗炎菌的相对丰度较低。为确定炎症性抑郁组与HC组之间的生物标志物，以及炎症性抑郁与非炎症性抑郁属水平之间的生物标志物，结合不同属构建了ROC曲线。ROC分析显示，AUC分别为81.73%和79.16%。
为进一步在种水平上识别特定的微生物群并指导炎症性抑郁症的治疗，使用宏基因组测序对20例炎症性抑郁症患者和20例HC的粪便样本进行分析。LEfSe分析显示，炎症性抑郁组有43种细菌的相对丰度显著降低，炎症性抑制组有9种细菌富集。为建立准确的炎症性抑郁诊断模型，结合所有不同物种构建ROC曲线，发现AUC为100%。
KEGG和KO数据库分析了两组之间的功能基因序列。发现炎症性抑制组中K00244（富马酸还原酶A）的表达明显降低。相关分析发现，K00244丰度与HAMD-17评分呈显著负相关（r =−0.439，P=0.005），与丁酸水平呈正相关（r=0.374，P=0.023）。炎症性抑郁症中一些减少的物种与hsCRP、SCFAs、K00244和抑郁症状相关。此外，莫吉杆菌多样性水平与hs-CRP和抑郁症状呈正相关。
与非炎症性抑郁组（n = 3）相比，炎症组显示炎症因子TLR-4、NF-κB、NLRP3、Caspase-1、TNF-RI、TNF-RII、MCSF增加。此外，生物标志物ZO-1和Occludin在炎症性抑郁组肠黏膜中的通透性降低（n = 3）。只有NF-κB、TNF-RII和Occludin之间的差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 肠道微生物群特征、肠黏膜炎症因子和炎症抑制的通透性生物标志物

二、动物研究部分

1.粪菌移植后小鼠的行为特征和肠道微生物组成

为确定与抑郁相关的行为表型是否与紊乱的肠道微生物群有关，进行了FMT实验。FMT后，高炎症组小鼠在蔗糖偏好试验（SPT）中消耗的蔗糖较少，表明小鼠表现出更多的快感缺乏症样行为（P < 0.05）。在野外试验（OFT）中，与低炎症组、HC组和空白组相比，高炎症组小鼠表现出活动减少（总行走距离减少）和焦虑增加（暴露中心区域远离壁的活动减少）（P<0.05）。同样，与HC组相比，高炎症组尾部悬吊试验（TST）的不动时间延长（P=0.061）和空白组（P=0.070），表明抑郁样行为增加。小鼠的体重在高炎症组明显低于低炎症组，HC组，和空白组（P < 0.05），和小鼠在高炎症组的体重变化小于其他组（P<0.05）。
为了确定液体摄入量对体重的影响，在行为测试中比较了小鼠的总液体摄入量。但两组间差异无统计学意义（P > 0.05）。这些行为测试表明，移植了炎症性抑郁症患者微生物群的小鼠表现出更低的体重、更小的体重变化、活动减少、焦虑增加和抑郁样行为。

图4 炎症性抑郁小鼠模型的行为特征和肠道微生物群组成

对小鼠粪便进行16S扩增子测序，确定粪菌移植后的定植情况。Alpha-多样性分析显示，高炎症组的Simpson指数低于低炎症组、HC组和空白组（P<0.05）。β多样性分析显示，通过Jaccard不相似性计算确定，高炎症组和其他组之间的细菌群落组成存在显着差异。采用LEfSe分析调查四组间微生物群差异，结果显示在高炎症组中，拟杆菌科和拟杆菌属的相对丰度显著较高；然而，HC组的梭菌目和梭菌属的数量明显更高。

2.高炎症组小鼠血清和脑内炎症因子升高

肠道渗漏会导致细菌通过肠道屏障进入循环系统，同时激活循环中的炎症反应，从而破坏血脑屏障，进而激活中枢神经系统的小胶质细胞，释放促炎细胞因子。检测小鼠血清和大脑中的炎症因子，发现血清中hs-CRP的浓度以及大脑中TLR-4，NF-κB，NLRP3，Caspase-1和IL-1β的表达与低炎症组，HC组和空白组相比，高炎症组增加（P＜0.05）。此外，使用免疫荧光评估了海马中小胶质细胞的数量和形态，发现高炎症组iba-1的面积密度和小胶质细胞的分支增加（P＜0.05）。

图5高炎症组小鼠血清和脑内炎症因子升高

3.益生菌丁酸梭菌（CB）对小鼠炎症性抑制模型的影响

为进一步研究高炎症小鼠肠道微生物群与抑郁症状之间的关系，向高炎症小鼠补充了CB，通过alpha多样性分析发现Simpson指数增加。通过beta多样性分析发现，高炎症组和CB组之间的细菌群落组成存在明显差异。此外，LEfSe分析显示，CB组中梭状芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌的丰度增加，拟杆菌科和拟杆菌的丰度降低。
与高炎症组相比，炎症因子TLR-4和NLRP3在肠粘膜中的表达，血清中hs-CRP的浓度，以及TLR-4，NF-κB，NLRP3，脑中Caspase-1和IL-1β的表达在CB组中降低（P＜0.05）。同时发现CB组通透性生物标志物Claudin-1和ZO-1增加（P＜0.05）；而occludin趋于增加，但差异无统计学意义。CB组海马小胶质细胞数量和分支减少（P<0.05）。

图6、7、8 益生菌丁酸梭菌（CB）对小鼠炎症性抑制模型的影响

使用行为测试来评估类似抑郁的行为，CB组小鼠在SPF组中比高炎症组或生理盐水（NS）组消耗更多的蔗糖（P < 0.05）。在OFT中，CB组的小鼠表现出增加的活动（延长的总行走距离）和减少的焦虑（增加了在远离墙壁的暴露的中心区域行走）（P<0.05）。同样，CB组TST的静止时间缩短（P < 0.05）。CB组小鼠体重显著增加，体重变化较大（P<0.05）。

研究意义与展望

1、本研究通过对MDD进行炎症性和非炎症性亚组分组，测定分析MDD患者的肠道微生物群、肠道通透性、SCFA浓度和炎症细胞因子浓度，发现炎症性抑郁症患者的促炎属增加，SCFA产生属减少。

2、通过粪便微生物群移植（FMT）和益生菌补充，发现紊乱肠道微生物群可以诱发炎症性抑郁，通过激活toll样受体4（TLR-4）/核因子kappa-B（NF-κB）和SCFA介导的炎症级联和SCFA产生，肠道微生物可以调节炎症反应并改善抑郁症状。

3、目前益生菌干预治疗在多种疾病中展现出非常理想的效果，本研究中发现直接补充关键菌群为最佳途径。该研究结果将为通过肠道微生物群和代谢组的改变来预防/干预/治疗炎症性抑郁症提供治疗靶点和科学依据以及相关经验。

4、本研究有一些局限性。首先，临床样本量很小，特别是肠粘膜，仅从12名受试者中收集了肠粘膜。其次，招募愿意接受乙状结肠镜检查或乙状结肠活检的无胃肠道症状的患者也具有挑战性。最后，在动物实验中样本量较小，挽救试验只做了动物，后续没有在临床试验中进行验证。