宏基因组揭示水产养殖环境耐药基因的移动和共存

中文题目：宏基因组揭示非集约化水产养殖环境和人类之间耐药基因的移动性和共存性

期刊及年份：Microbiome，2024年6月

https://doi.org/10.1186/s40168-024-01824-x

通讯作者：毛艳萍，深圳大学化学与环境工程学院，研究兴趣在于了解更多关于废水处理过程的机制和重要功能细菌的生态学。利用微生物组学方法用于研究基因表达是如何被调控的，并发现以前未被认识的生化途径，这可能对理解细胞内的能量、碳、氮和磷等循环代谢至关重要。

摘要：水产养殖是全球重要的食品来源。集约化大规模养殖中抗生素的广泛使用导致了抗药性的产生。非集约化水产养殖是另一种有利于生态保护且与自然环境紧密相关的水产养殖模式。然而，非集约化水产养殖中的抗性基因传递尚未得到充分表征。此外，水产养殖中的抗性基因对人类健康的影响还需进一步研究。本研究采用宏基因组学方法，鉴定了水产养殖抗性基因的迁移性，并评估其对人类健康的潜在风险。研究结果表明，抗生素抗性基因（ARGs）广泛存在于非集约化水产养殖系统中，其中多药抗性基因最为丰富，占34%。非集约化水产养殖环境中的ARGs主要由微生物群落决定，占51%。网络分析表明，77个属和36个移动遗传元件（MGEs）与23种ARG类型显著相关（p < 0.05）。六种ARG被定义为核心ARG（丰度排名前3%，出现频率>80%），占鱼肠样本中ARG丰度的40%。共鉴定出71个携带ARG的环状DNA，其中75%同时携带MGEs。qacEdelta1和sul1形成了稳定的组合，并在水产养殖环境和人类中同时检测到。此外，恢复了475个高质量的宏基因组组装基因组（MAGs），其中81个MAGs携带ARGs。MAGs中最丰富的ARG类型是多药和杆菌肽抗性基因。值得注意的是，Fusobacterium_A（一种机会性人类病原体）携带的ARGs和MGEs在水产养殖系统和人类肠道中均被检测到，表明ARGs转移的潜在风险。

主要内容

采样

采样活动在中国南部的一个非集约式水产养殖场进行（东经113.33度，北纬22.10度）。该养殖场饲养的鱼和鸡不使用抗生素。鸡只喂食不含抗生素的天然谷物，鱼饲料的组成可以在补充表S1中找到，鱼塘水中的抗生素和金属浓度已经测量。从不同生长阶段、不同体重的鸡收集鸡肠道样本。收集了包括鲤鱼、罗非鱼、草鱼、鳙鱼和鲫鱼在内的不同种类的鱼肠道样本。将鱼肠道标本挤出，小心收集内容物，以避免肠道组织的污染。从鸡舍收集新鲜鸡粪作为鸡肠道样本。在鱼塘的四个角落收集沉积物和水样本，然后分别混合。对于每个水样本，使用0.22微米微孔膜过滤300毫升水，以富集微生物。所有样本均储存在-80℃直到进行DNA提取。最终，共收集了35个样本，包括6个鸡肠道、17个鱼肠道、8个沉积物和4个水样本。

为了进一步分析水产养殖系统与人类之间抗性基因组的共享情况，从NCBI SRA数据库下载了30个关于当地人类肠道（中国广东省）的宏基因组数据集。根据参考文献，志愿者在采样前2个月没有接受任何抗生素治疗。选择了大小大于4.5Gb的宏基因组数据集，总共下载了311.6Gb的数据。在后续分析之前，根据人类基因组参考（hg18）对原始数据进行过滤，以消除人类宿主DNA。

水产养殖环境中的ARG

图1.各样品的ARG组成和丰度分布图。(a) ARG相对丰度热图（对数转换）。顶部的不同颜色块表示不同的样本组。(b)不同样品组中ARG丰度的箱形图。组间的显著差异用星号表示，t检验（*p < 0.001）。(c) PCoA显示基于ARG丰度谱的样本聚类（95%置信区间）

共检测到22种类型和576种亚型的ARG，不同样本组间ARG的分布略有差异（图1a）。总体而言，多药耐药基因（MDR）在水产养殖系统样品中相对丰富，约占总ARG丰度的34%。相比之下，大环内酯林可酰胺-链阳性菌素（MLS）和四环素耐药基因在人类肠道样本中更丰富，约占总ARG丰度的24%和41%。MDR和四环素抗性基因在鸡肠道中的分布相对丰富，分别占30%和35%。沉积物和水体中MDR和杆菌肽耐药基因的丰度较高，分别为31%和27%。有趣的是，我们观察到MDR始终是五种不同食性鱼类中最丰富的ARG（即草鱼、鳙鱼、罗非鱼、鲤鱼和鲫鱼）。在鸡、鱼、沉积物、水和人肠道中检测到的所有ARG类型的平均丰度分别为0.050±0.03、0.002±0.001、0.006±0.002、0.005±0.0009和0.030±0.04拷贝/拷贝16S rRNA基因。（数据表示为平均值±标准偏差）。与其他样品组相比，ARGs在鸡肠道和人肠道中的平均丰度较高。人类肠道中ARGs的丰度与鱼肠道、沉积物和水显著不同（t检验，p < 0.001）（图1b）。为了比较不同样品组中ARG的组成，进行了基于Bray-Curtis距离的PCoA，观察到样品组之间的明显聚类（p < 0.01）（图1c）。水体和沉积物中ARGs的聚类分析结果表明，二者的ARGs组成没有显著差异，而鱼内脏样品中ARGs的组成则是独立的。

水产养殖核心ARGs的确定

图2.水产养殖系统中的核心ARGs。(a)UpSet图显示了在不同样本组之间共享和唯一的ARG的数量。实心黑点表示样品组中的ARG出现，由线连接的点表示不同样品组共享的ARG。顶部的条形图显示了样本组唯一或共享的ARG数量，左侧的条形图显示了检测到的ARG亚型的总数。(b)维恩图显示了人类肠道和水产养殖系统共享的ARG数量。(c)堆积百分比直方图显示典型和核心实时地质储量的构成（用不同颜色表示）。人类肠道和环境典型ARGs定义为分别在所有人类肠道和环境样本（鱼塘沉积物和水样本）中检测到的ARGs。鱼肠典型ARG定义为在24%的鱼肠样品中检出ARG，鸡肠典型ARG定义为在50%的鸡肠样品中检出ARG

为了更好地了解水产养殖和人类肠道之间的ARG的联系，确定了不同样品组之间的共同和不同的ARG。在人类肠道中检测到457种ARG亚型，其中195种是唯一携带的（图2a）。在人类肠道和水产养殖系统中同时检测到262种ARG亚型（图2b），占人类肠道携带的ARG的57%。值得注意的是，所有5个样品组中均存在85种ARG亚型，其中66种ARG亚型同时存在于人肠道和鸡肠道中（图2a），表明水产养殖系统和人类之间的ARG存在一定的重叠。

根据水产养殖系统中ARG的发生频率，确定了水产养殖系统的核心ARG。亚型数量与检测到的ARG发生频率之间的负相关性（R2 = 0.892）表明，水产养殖系统中持久性ARG的数量有限。值得注意的是，只有6种ARG亚型的发生频率大于80%（描述为核心ARG），229种ARG亚型的发生频率小于20%（描述为一过性ARG）。此外，核心ARG的平均丰度为5.95×10^-3拷贝/拷贝16S rRNA基因，而瞬时ARG的平均丰度仅为7.31×10^-5拷贝/拷贝16S rRNA基因，远低于核心ARG。总体而言，核心ARGs的低多样性，但高丰度的水产养殖系统中发现。这些核心ARGs分别占水产养殖系统和人类肠道中ARGs组成的29%±20%和4%±2%（图2c）。值得注意的是，核心ARG占据了鱼肠道样品中ARG丰度的很大一部分（40%±21%）。

水产养殖系统中ARGs的影响因素

图3.水产养殖系统中ARGs的影响因素。(a)网络分析显示ARGs、MGEs和细菌（属水平）之间存在相关性（p < 0.05）。节点越大表示连接越多。红线表示正相关，绿色线表示负相关。(b) VPA显示了MGE和细菌对ARG的判读率。(c)ARG丰度与MGEs数量之间的线性关系（p < 0.001）。(d) ARG丰度和MGE丰度之间的线性关系（p < 0.001）（不包括离散的样本点f3、f4和f15）

一些结果表明，水产养殖ARG是由微生物群落和MGE形成的。首先，ARG的丰度与MGE的数量（图3c）和丰度（图3d）显著相关。其次，使用网络分析来探索ARG、MGE和潜在主机之间的关联（图3a）。77个属和36个MGE与23个ARG类型显著相关（p < 0.05）。网络分析结果的详细信息见表。结果表明，鱼腥藻属、束丝藻属、拟小球藻属和拟针球藻属与13个ARG有显著的相关性。观察到梭杆菌与8个ARG相关。插入序列（IS）是与ARG相关的主要MGE类型，约占所有MGE类型的75%。Tn916和qacEdelta分别与16和13个ARG相关。氨基糖苷类、磺胺类和磷霉素耐药基因与最多的属和MGE相关。在基于重叠群和MAG的分析中也观察到这些ARG潜在宿主以及ARG和MGE之间的相关性。最后，通过VPA进一步定量表征了MGE和细菌对ARG的影响（图3b）。VPA结果表明，细菌植物群可解释ARGs谱的51%，MGE可解释其余19%。

多种ARG和MGE组合的共同出现

图4.基于重叠群的ARG和MGE的共现模式。(a) ARG和MGE的共现发生率。x轴表示ARG-MGE的距离，y轴表示共现发生率。随着距离的增加，共现率也增加，并逐渐达到峰值。(b)人肠道和水产养殖系统中ARG-MGE的最短距离（**p < 0.01表示显著差异）。(c)不同样本组中sul 1-qacEdelta 1和邻近基因的基因排列模式。不同颜色的重叠群属于不同的样本群，红色的分类名称表示条件致病菌

水产养殖系统中ARG的转移风险通过ARG和MGE之间的共现发生率和平均最小距离进行评估。随着与ARG距离的增加，MGE共存的发生率增加（图4a），水产养殖系统中ARG和MGE之间的距离显著短于人类肠道中的距离（p < 0.001）（图4b）。为了进一步揭示ARG和MGE的共现模式，我们分析了从所有样品中检索到的宏基因组组装的重叠群上的两个元件的遗传位置。总体而言，共确定了71个ACC，其中53个ACC（75%）携带MGE，21个ACC（30%）携带多种ARG，10个ACC（14%）同时携带多种ARG和MGE。此外，还调查了水产养殖系统和人类肠道样品中ARG和MGE的共存情况，观察到ARG和MGE的各种共存模式。氨基糖苷类耐药基因aadA、磺胺类耐药基因sul1和季铵化合物qac、耐药基因qacEdelta1形成稳定的组合，并且存在于不同的样品组中（图4c）。

携带ARG的基因组（ACG）的鉴定和定量

图5. Circos图显示了不同MAG携带的ARG。最外面的圆圈表示MAG门级和ARG类型，灰色矩形表示MAG和ARG亚型的数量，最里面的连接线根据ARG类型着色

回收MAG和检测ACG可以深入了解ARG的宿主并评估潜在的转移风险。总共回收了475个高质量MAG，并注释了460个非冗余MAG的分类。在门水平上，最丰富的细菌是厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门，12个箱被鉴定为机会致病菌。Circos图显示了MAG中ARG的分布（图5），MDR和杆菌肽抗性基因是MAG携带的两种最丰富的ARG。值得注意的是，MAG携带的MDR包含29种亚型，而杆菌肽耐药基因仅包含巴卡A亚型。

图6. 热图显示了ACG丰度、迁移率和携带的ARG类型。(a)颜色条A表示ACG携带一个或多个ARG。颜色条B表示ACG不携带MGE、携带一个MGE或携带多个MGE。颜色条C表示从中回收ACG的样品组。热图显示了不同样品组中ACG的平均丰度（数据经对数转换）。ACG名称标签为红色表示机会致病菌。(b) ACG携带的ARG类型数量。颜色表示携带的ARG编号

热图进一步显示了不同样本组中ACG的相对平均丰度以及携带的ARG类型（图6）。引人注目的是，一些ACG携带多个ARG，这些ARG可能是高度移动的。在所有81个ACG中，23个携带多种ARG，18个携带MGE，6个ACG同时携带多种ARG和MGE（表S10），这些基因组被认为具有高ARG富集和迁移率，因此具有促进ARG传播的高风险。这6个ACG为hg_bin.40（梭杆菌属_A sp 900543175），hg_bin.256（真杆菌属_G sp 000434315），hg_bin.49（猪霍尔德氏菌），fg_bin.37（醋酸因子），fg_bin.33（Solirubrocellales细菌67-14）和cg_bin.33（微囊藻科）分别携带48、46、38、7、6和2个ARG，其编码杆菌肽、β-内酰胺、磷霉素、磷霉素、春雷霉素、MLS、MDR、多粘菌素，和四环素耐药性。特别是，确定了11个携带核心ARG的MAG。5个MAG携带多个核心ARG，7个MAG也携带MGE，而没有携带核心ARG的MAG被鉴定为机会致病菌。值得注意的是，hg_bin.40同时携带MGE和4种核心ARG，且hg_ bin.40在鸡肠道和人肠道样本中的相对丰度均较高（图6a），提示存在核心-ARG转移的潜在风险。

结论

本研究探讨了在未充分研究的非集约化水产养殖环境中耐药菌的传播能力和对人类健康的潜在风险。已确定多种类型的ARG在水产养殖环境中可能具有流动性。检测到的ARG-MGE组合在人类肠道和水产养殖系统之间存在潜在的转移风险。携带多种ARG的条件致病菌在水产养殖系统和人类肠道之间的潜在转移可能会增加人类疾病的风险。总之，我们的研究强调了水产养殖环境，即使抗生素应用几乎为零，也是ARG的“隐藏”水库，并表明耐药基因跨越人类环境边界的潜在流动性。