荚膜型别与肺炎克雷伯菌逃避肝脏库普弗细胞捕获的能力

PLoS Pathog 18(8): e1010693.

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010693

摘 要

在体外条件下，荚膜增强了细菌对吞噬、抗菌肽和补体沉积的抵抗力。然而，荚膜在肺炎克雷伯菌

血流感染过程中的确切作用仍有待阐明。

本研究显示，荚膜通过保护细菌不被肝巨噬细胞（库普弗细胞，KCs）捕获，促进肺炎克雷伯菌在血流中的存活。有荚膜菌株在不同程度上以荚膜型别依赖的方式绕过此抗菌机制。某些高毒力荚膜型别完全阻断KCs的捕获。

此外，KCs对低毒力菌株的捕获在体内仅可被同型别的游离荚膜多糖所中和，表明KCs对荚膜的识别具有特异性。用灭活的肺炎克雷伯菌免疫可使KCs捕获高毒力菌株。

前 言

肺炎克雷伯菌有80多种荚膜型别，在毒力性状上有很大差异，高毒力分离株局限于K1、K2、K16、K28、K57和K63等荚膜型别，尤其K1和K2型与全球约70%的高毒力肺炎克雷伯菌感染病例有关。

肝巨噬细胞（库普弗细胞，KCs)被认为是在肝窦中履行肝脏抗感染功能的主要吞噬细胞，约占体内所有常驻巨噬细胞的90%。KCs已被证明在控制肺炎克雷伯菌感染中发挥关键作用，但尚不清楚KCs与肺炎克雷伯菌荚膜的相互作用。

本研究发现，在86株肺炎克雷伯菌所致小鼠败血症模型中有几种荚膜型别在致死性方面有显著优势。利用ATCC 43816（K2型）菌株的衍生物进一步证明，荚膜类型可以提示肺炎克雷伯菌的毒力水平，低毒力和高毒力表型的主要原因是荚膜与KCs之间的分子相互作用，疫苗接种激活了KCs对高毒力菌株的抗菌能力。

结果与讨论一、荚膜型别决定了肺炎克雷伯菌的毒力水平

利用小鼠脓毒症模型评估了81株来自血液和其他无菌身体部位(如胆汁、骨髓、脑脊液、关节液、尿液和脓液)的侵入性分离株和5株实验室菌株的毒力水平，包括25种荚膜型别和35种MLST型。毒力以腹腔注射后小鼠7d的死亡率为特征，将这些菌株分为高毒力（40株）和低毒力（46株）两组，其中高毒力菌株7d内死亡率的临界值为50%（图1A）。高毒力菌株感染通常会在12至48小时内导致100%的死亡率，而低毒力菌株感染的小鼠大多存活（图1D）。高毒力菌株在12和24小时通常表现出较高的菌血症水平，而低毒力菌株在血液中没有或仅能检测到（图1C和1E）。进一步分析表明，毒力表型与荚膜型别相关（图1A）。K1、K2、K16和K20菌株均表现出高毒力表型; 除K47型中包括2株高毒力和8株低毒力菌株外，其余荚膜型别菌株均表现为低毒力表型。

图1. 不同肺炎克雷伯菌菌株的毒力差异。

为了验证仅荚膜型别是否可以定义毒力表型，我们构建了高毒力菌株ATCC43816 (K2型)的荚膜型别转换衍生株。结果显示，荚膜表达量和粘度与毒力表型之间无明显相关性（图2D和图2E）。综上，荚膜型别

是肺炎克雷伯菌毒力的主要决定因素。

图2. 荚膜型别在肺炎克雷伯菌毒力的作用。

二、肝脏是荚膜免疫逃避的主要靶器官

我们比较了小鼠静脉注射肺炎克雷伯菌后血液中高毒力和低毒力菌株的动态变化。

结果表明，低毒力菌株在60分钟后血液中即无法检测到，而高毒力菌株在前3小时内短暂性减少，随后恢复。

进一步更短间隔采样显示，低毒力菌株在20 min后血液中即检测不到，而高毒力菌株的菌血症水平仅略有降低。这一结果表明，脓毒性感染中肺炎克雷伯菌的荚膜型别依赖性结局或毒力表型是由早期血源性细菌的不同清除率决定的。

从血液中清除的细菌在被肝脏和其他器官捕获后可以被有效杀死。肺炎克雷伯菌通过以荚膜型别依赖的方式逃避肝脏捕获和杀死，促进细菌存活和毒性。

三、荚膜型别决定了库普弗细胞在肝脏中捕获肺炎克雷伯菌的能力

实验结果显示，消耗中性粒细胞和单核细胞后没有影响清除率和肝脏捕获。相反，消耗巨噬细胞后显著削弱了细菌清除和肝脏捕获。表明，巨噬细胞而不是中性粒细胞或单核细胞负责捕获肝脏中的低毒力肺炎克雷伯菌。库普弗细胞（KCs）特异性消耗实验结果表明，荚膜主要通过逃避肝窦中KCs的捕获，促进肺炎克雷伯菌在血液中的生存。

四、KCs识别荚膜多糖

实验结果表明，KCs通过识别CPS捕获肺炎克雷伯菌，并且KCs对CPS的识别具有荚膜类型特异性。

五、接种疫苗可使KCs捕获肺炎克雷伯菌以获得保护性免疫

免疫接种显著促进了抗肺炎克雷伯菌IgG抗体的产生。用灭活肺炎克雷伯菌进行免疫接种，可以有效地预防高毒力菌株的致命感染。

在脓毒性感染后，免疫小鼠中的高毒力菌株被有效清除， 30分钟内86.0%的活菌存在于免疫小鼠的肝脏。这些数据表明，疫苗接种使肝脏能够捕获高毒力菌株。肝窦的IVM成像结果表明KCs是免疫后捕获高毒力菌株的主要免疫细胞。

结 论

荚膜类型决定了肺炎克雷伯菌的毒力；

低毒力菌株可有效被KCs细胞捕获，高毒力菌株可逃避此抗菌机制；

灭活疫苗使KCs能够捕获高毒力菌株，保护小鼠免受致命感染。