【文献速递】同时产KPC-2和AFM-1碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌高危克隆ST463

【据《Emerging Infectious Diseases》2023年10月报道】题：同时产KPC-2和AFM-1碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌高危克隆ST463，中国，2020-2022

【背景】

产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌对全球公众健康构成威胁。全球流行的铜绿假单胞菌高危克隆包括ST235、ST277、ST175、ST233和ST111。最常见的碳青霉烯酶类型是金属酶，例如VIM和IMP。在中国，产KPC克隆ST463已经发展成为主要流行克隆。

【结果】

在2020年9月至2022年6月期间，研究收集了中国浙江省一家医院的192株来自192名患者的非重复碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）菌株。这批菌株中产碳青霉烯酶CRPA属于10个不同ST型，占比41.1%（79/192）。研究发现8株同时产KPC-2和AFM-1的CRPA（KPC-2-AFM-1 CRPA），其中3株为定植菌，5株与感染相关（表）。病人（6男2女）年龄在45-90岁，都有复杂病情和ICU入住病史。4名患者接受了具有抗KPC-2-AFM-1 CRPA活性的抗菌药物治疗（粘菌素单药治疗）；5名细菌感染患者最终死亡；3名细菌定植患者已出院。

8株CRPA均为ST463，携带相同的耐药基因和III型分泌系统（T3SS）exoU+/exoS+，相差5-30个SNP，提示存在克隆传播。所有菌株都1个携带bla_KPC-2的质粒。质粒具有相同的骨架结构，在插入片段处有差别。在质粒p94中ISKpn27-bla_KPC-2-ISKpn6保持完整，但其余7株菌的质粒中缺失ISKpn6及其上游基因（(ISKpn6-open reading frame-klcA-open reading frame）。所有质粒均为I型质粒，但是缺失16 kb的移动元件，提示它们不是接合质粒，接合试验证明了这一点。

对125株ST463菌株（68株来自NCBI数据库，57株来自本研究）进行系统发育树分析，发现菌株可以被分为2簇（图1）。Clade 1菌株分离时间早于Clade 2菌株。Clade 1菌株主要来自美国，不产KPC和AFM。Clade 2菌株来自中国，并且大部分产KPC，部分产AFM。ST463菌株在中国独立进化可能与KPC和AFM的获得相关。Clade 2菌株的SNP差异在0-60个，提示产KPC ST463菌株在中国克隆传播。8株KPC-2-AFM-1 CRPA与3株产AFM菌株归为单独一小簇，推测KPC-2-AFM-1 CRPA克隆可能来自产KPC ST463菌株。

Clade 1菌株序列无法和p94比对上，表明中国之外其他国家的ST463菌株不含I型质粒。通过BLAST获得40个I型质粒（和p94相比>50% coverage和>95% identity），它们属于14个不同铜绿假单胞菌ST型，推测I型质粒可以在菌种内广泛传播。质粒系统发育树显示KPC-2质粒归为独立分支。blaKPC-2邻近序列出现多拷贝IS26，表明IS26在质粒进化和耐药基因传播中起了重要作用。我们推测出一个潜在的进化路线：ST463铜绿假单胞菌先获得可接合的I型质粒，再通过IS26获得KPC序列，最后染色体上整合了blaAFM-1,形成KPC-2-AFM-1 CRPA。为了证实这一猜想，我们比对了ZY94和1755（不产KPC和AFM，但与KPC-2-AFM-1 CRPA亲缘关系接近）。1755携带1个质粒（p1755），与p94有高度同源性（81% coverage和99.76% identity）。P94可能是由p1755通过IS26介导的blaKPC-2基因簇插入进化而来。对比2株菌染色体发现携带blaAFM-1的多重耐药序列的插入事件，该序列两侧有IS5564和6 bp重复序列（GCTAGA）。

8株KPC-2-AFM-1 CRPA对β-内酰胺类抗生素、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复方制剂、喹诺酮类抗菌药物和庆大霉素均耐药，对阿米卡星敏感，对多粘菌素中介。我们发现头孢他啶/阿维巴坦和氨曲南对8株菌有联合作用。与铜绿假单胞菌菌株ATCC27853相比，所有菌株对氯己定（一种常用的医用消毒剂）的MIC升高4倍，表明它们对氯己定具有耐受性。

8株菌呈现小克隆表型并有强生物膜形成能力。我们挑选ZY94和ZY1214评估其稳定性、干燥抗性和毒力。在LB中传代10天后，ZY94和ZY1214仍保持小克隆表型，并且KPC质粒和blaAFM-1基因能够稳定遗传。在干燥聚苯乙烯表面进行8天生存试验，ZY94和ZY1214存活菌量高于NDTH6412和PAO1（图2）。此外，在小鼠腹腔感染模型中，ZY94和ZY1214菌株的致死率明显高于ATCC9027（p＜0.05），但低于PA14（图2）。

【结论】

本研究报道了ST463 KPC-2-AFM-1 CRPA在中国一家医院出现并提出了潜在的进化路线。广泛耐药性、消毒剂抗性、干燥抗性、强大的生物膜形成能力和高稳定性使这些菌株能够对抗宿主和临床环境的挑战，从而推动这种高危克隆的持续传播。持续监测和更严格的感染控制措施对防止后续感染暴发至关重要。