扩增子测序入门必备小贴士，常见问题我来答（三）

#多元统计分析问题#

Q1:如何选择Metastat、Wilcoxon、Kruskal-Wallis及LEfSe等统计分析的结果？

我们知道这四种分析所使用的统计检验方法有所不同，因此得出的结果也会存在差异。

Metastat、Wilcoxon分析是在多个分组之间进行两两比较，从而检验每两组比较间的差异物种。而Kruskal Wallis和LEfSe是在三组或更多分组之间进行比较，从而检验多组共同比较下的差异物种，不会涉及组间两两比较的结果。这四种统计分析方法的检验结果，可以根据研究背景选择结果较符合的使用。

Q2:LEfSe 结果如何解读？

1、LEfSe软件参数设置：

LEfSe分析可以实现多个分组之间的比较，从而找到组间在丰度上有显著差异的物种（即biomaker），其分析原理有如下三步：

1)首先在多组样本中采用的参数检验ANOVA检验检测不同分组间丰度差异显著的物种，阈值设定0.05；

2) 对上一步中获得的差异显著物种，再用成组的Wilcoxon秩和检验来进行组间差异分析，阈值设定0.05；

3) 最后用线性判别分析（LDA）对数据进行降维和评估差异显著的物种的影响力（即LDA score），阈值设定为2。

LEfSe软件默认设置的LDA score阈值是2，LDA score大于2的差异物种即认为具有标志性。LDA score越大，代表差异物种的影响越大。如果阈值为2时筛选出来的差异物种过少或过多，也可适当调整阈值大小。

2、LDA柱状图解读

LDA柱状图中展示的是差异显著且LDA score大于设定阈值的物种，即筛选出的具有统计学差异的biomaker。柱状图中柱子长度代表显著差异物种的LDA score值大小。

着色原则：biomaker在哪个组中富集（即在哪个组中相对丰度最高）就将该物种着色为这个分组的颜色。如果有特定分组没有出现在图中，说明所有差异显著物种在这个分组中的相对丰度都比较低或不存在（即这些物种没有在这个组中富集）。

3、进化分支图解读

图中由内至外辐射的圆圈代表由门至属（或种）的分类级别。在不同分类级别上的每个圆圈代表该分类水平下的一类物种，圆圈直径大小与相对丰度大小呈正比。图中英文字母表示的具体物种名称见右侧图例。

着色原则：无显著差异的物种统一着色为黄色，差异物种biomarker跟随分组进行着色，红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物类群，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，其它圈颜色意义类同。

4、lefse.res 格式文件解读：

该文件共5列：

第一列是biomarker名称；第二列是物种在各分组中平均丰度最大值的log10的值，如果平均丰度小于10的按照10来计算，如果平均丰度小于10的按照10来计算；第三列是差异基因或物种富集的组名称；第四列是LDA值；第五列是参数检验ANOVA分析的p值，如果不是biomarker则用“-”表示。
Q3:环境因子相关性分析(RDA\CCA)结果如何解读？

RDA/CCA分析又称多元直接梯度分析，主要用来检测环境因子、样本、菌群三者间的关系或者两两之间的关系。RDA/CCA分析将对应分析与多元回归分析相结合，每一步计算均与环境因子进行回归，其中RDA是基于线性模型进行分析，CCA是基于单峰模型进行分析。

RDA或CCA模型的选择原则：先用species-sample数据(97%相似性的样本OTU表)做DCA分析，看分析结果中Lengths of gradient第一轴的大小，如果大于4.0，则选CCA，如果在3.0-4.0之间，选RDA和CCA均可，如果小于3.0，RDA的结果要好于CCA。

CCA模式分析结果解读：

图中红色射线代表不同的环境因子，射线的长短代表该环境因子对于物种组成的影响程度（解释量）的大小；环境因子射线间的夹角代表环境因子间的正、负相关性（锐角：正相关；钝角：负相关；直角：无相关性）。

黑色圆点代表样本，图中两圆点间的距离越近，说明两个样本的群落结构组成差异越小，相似度越高；从样本点向环境因子的射线做垂直投影，投影点距离环境因子射线指向方向越近，环境因子对样本群落结构的影响越大。

蓝色三角代表物种，用线段连接物种与样本，线段的长短代表了相应样本中目标微生物丰度的大小，线段越长丰度越小。

RDA模式下物种呈现为向量，向量的指向方向表示该物种丰度增加的方向。其他解读同CCA模式。