【文献速递】中国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌荚膜血清型、抗生素耐药性和毒力因子分布的纵向多中心研究

摘要

CRKP因其多重耐药性和高死亡率而成为公众健康的“严重”威胁。为了设计针对CRKP表面多糖抗原的免疫策略，迫切需要了解全国范围内CRKP耐药，毒力和血清流行病学，从而获得更精确的流行病学数据来促进针对CRKP感染的有效预防策略制定。本研究进行了为期五年（2016-2020）的多中心研究，通过多种分子生物学和生物信息学方法，包括全基因组测序、PCR筛查、荚膜Quellung试验、宏基因组测序和分析、RNA测序和实时定量PCR、生物膜形成测定、血清耐药性测定等方法揭示了中国不同地区CRKP血清型、耐药性和毒力决定因素分布的机制。研究阐明了中国不同地区CRKP血清型和流行病学特征的动态变化。揭示了两个热点地区的存在，导致了大部分CRKP全国传播，并提出CRKP传播与频繁跨区域患者进入这些热点城市有关。此外，还发现荚膜缺陷菌株和O抗原缺陷菌株在各类感染中普遍存在，并揭示了荚膜缺陷菌株的耐血清杀伤机制。这项研究增进了对中国CRKP血清型流行情况和变化的了解，并强调了持续监测血清型变化（包括荚膜/O抗原缺陷菌株）对于制定针对CRKP感染的免疫策略的重要性。

研究结果

1、CRKP分离株荚膜和抗菌药物分析

对1017株非重复CRKP分离株进行分析。在98.2%（999/1,017）的CRKP分离株中，通过PCR检测到碳青霉烯酶基因，其中绝大多数是blaKPC-2（89.4%，909/1,017），其次是blaNDM（4.8%，49/1,017）和blaOXA-48-like（1.8%，18/1,017）。我们鉴定了18株不产碳青霉烯酶的CRKP分离株，其中15株（83.3%）同时具有孔蛋白（Ompk35/Ompk36）突变和超广谱β-内酰胺酶基因。荚膜基因分型显示58个不同的K位点；大多数属于KL64（50.4%）和KL47（25.9%）。这两种K型的频率随时间和地理位置而变化（图1b）。通过基因测序PCR显示了K型之间抗菌药物敏感性和碳青霉烯酶基因分布的表型差异。排名前7位的K型主要与blaKPC-2相关，blaKPC-2对头孢他啶-阿维巴坦（CZA）敏感，对阿米卡星（KL19除外）耐药，而KL51和KL60中56.5%的分离株携带blaOXA-48-like。值得注意的是，超过三分之一的KL51、KL15和其他稀有K型分离株携带blaNDM，并表现出对CZA的耐药性。

图1：2016-2020年中国26个省市收集的CRKP分离株的荚膜基因型和抗菌素分析

2、CRKP分离株携带毒力因子分析

通过PCR筛选了所有CRKP分离株中5个高毒力相关基因，rmpA、rmpA2、iroB、iucA和peg344，并将携带iucA和rmpA/rmpA2基因的413个（40.6%）分离株分类为高毒力CRKPs（hv-CRKPs）。大多数hv-CRKP来自K型KL64（312/413,75.5%）和KL47（67/413,16.2%）。值得注意的是，在前十大K型菌株中，KL60的hv-CRKP菌株含量最高（7/11,63.6%），其次是KL64（312/513,60.8%）、KL62（5/12,41.7%）和KL47（67/263,25.5%）（图2a）。在2016-2020年期间，KL64中hv-CRKP的频率保持稳定（P值=0.61）（图2b）。河南（88.2%）、浙江（87.8%）、北京（81.8%）和江苏（80.7%）的KL64中hv-CRKP含量较高，而上海（81.3%）和辽宁（69.0%）的KL47菌株为hv-CRKP的比例较高。相反，在整个研究期间，湖北和四川的KL64（28.2%，21.2%）和KL47（0%，0%）分离株的hv-CRKP频率较低。值得注意的是，辽宁（2016-2019年，P值=0.019）和北京（2016-2020年，P值=0.037）的KL47 hv-CRKPs患病率显著增加（图2b）。

图2：抗微生物药物耐药性和高毒力相关基因在CRKP菌株中的分布

3、中国KL47和KL64 CRKP的基因组流行病学

通过对 207个KL47和319个KL64分离株进行了全基因组测序，发现其中＞99% （523/526）属于序列类型ST11。ST11中44个K型和6个O型之间存在较强的相关性，其中KL64：O2和KL47：OL101占菌株的61%（2187/3570），尤其是L1中的菌株。ST11中最常见的碳青霉烯酶是blaKPC-2，其次是blaOXA-48和blaNDM-1。

4、L1 CRKP在中国境内的时空传播

研究分析了CRKP在中国的传播动态，KL47菌株通过不同的模型估计起源于浙江或北京，所有模型估计KL64分支起源于浙江。北京和上海是导致KL47和KL64菌株在中国各地不同地理流行率的传播枢纽。KL47毒株的许多主要传播涉及北京及其邻近的北方地区。相反，KL64菌株估计经历了从上海到中国中部和东部的九次主要传播。

图3：ST11菌株的种群结构和L1谱系的传播模式

5、KL64和 KL47分离株中无荚膜CRKP特征

所有通过基因分型鉴定为KL64或KL47的分离株均进行血清学分型，发现了非荚膜CRKP（NEKp）的存在，这些分离株呈半透明状，多糖囊糖醛酸显著减少。NEKp菌株通过增加生物膜形成、血清耐药性和抗血清杀菌活性（SBA）表现出适应性优势，但在传播和抗吞噬作用方面存在不足。

图4：临床分离株中的荚膜缺失

6、NEKp菌株在感染压力下的表征

在体外和体内比较了NEKp/荚膜缺失（等基因Δcps）菌株与EKp（产荚膜肺炎克雷伯菌）菌株，以评估荚膜合成对适应性的影响。结果表明，荚膜合成的破坏增强了O抗原的合成，并最终提高了抗血清能力。观察表明，Und-P动力学的改变与血清耐药性的变化之间存在潜在的联系。尽管如此，CPS合成破坏后的确切机制和精确的Und-P通量变化仍有待进一步研究。此外，与亲本KL47/KL64 EKp菌株相比，同基因Δcps突变体在血清杀菌活性（SBA）测定中对从肺炎克雷伯菌KL47/KL64感染患者收集的热灭活血清表现出更高的耐药性，表明荚膜耗竭是逃避体液免疫反应的潜在机制。

图5：荚膜合成对体外和体内适应性影响的评估

图6 ：NEKp菌株在感染压力下具有生存优势

7、KL64或KL47 CRKP分离株中的O抗原缺陷菌株

在KL64和KL47 CRKP分离株中发现了O抗原缺失株，这些菌株在临床样本中的普遍存在通过基因组测序得到了证实。

总结

该研究对2016年至2020年间中国40家医院患者中收集的1017株CRKP分离株进行了纵向分析。毒力基因和荚膜分型显示CRKP荚膜型KL64扩增（59.5%），同时KL47患病率降低。高毒力CRKP的患病率从2016年的28.2%上升到2020年的45.7%。系统发育和时空分析显示，北京和上海是中国KL47和KL64毒株地理流行的传播中心。该研究在各种感染样本中鉴定出了相当比例的荚膜或O抗原缺陷菌株，并研究了这些荚膜缺陷菌株获得生存优势的潜在基础。这些发现为研发控制CRKP感染的有效新策略提供了重要基础。

参考文献

Hu F, Pan Y, Li H, et al. Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae capsular types, antibiotic resistance and virulence factors in China: a longitudinal, multi-centre study [J]. Nature Microbiology, 2024, 9(3): 814-29.