文献解读 | 临床难治性铜绿假单胞菌携带blaAFM高拷贝IncP-2巨质粒，导致头孢地尔高水平耐药！

文章标题：High-copy IncP-2 megaplasmid carrying blaAFM in clinical difficult-to-treat resistance Pseudomonas aeruginosa: Associated with high-level cefiderocol resistance

发表时间：2025.2

发表期刊：The Journal of infection

DOI：10.1016/j.cmi.2024.01.014

IF：14.3

概述

本研究首次在临床碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）中发现了对头孢地尔（FDC）高水平耐药的菌株。研究发现，低水平耐药和高水平耐药的菌株，均携带含有blaAFM基因的IncP-2巨质粒。然而，高水平耐药菌株的质粒拷贝数显著高于低水平耐药菌株，导致blaAFM基因的表达量显著增加，这可能是其产生高水平头孢地尔耐药的主要原因。此外，IncP-2质粒还影响了细菌的毒力和生物学特性，例如诱导小菌落变异（SCV）表型并改变生物膜形成能力等。

知识点

头孢地尔：一种新型铁载体头孢菌素。

blaAFM：碳青霉烯类耐药基因，与blaNDM有最近的关系（80%以上的序列相似性）。

研究结果

1、临床背景及耐药表型：

从2016年至2023年收集的225株碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）中，鉴定出5株产生AFM的头孢地尔（FDC）耐药菌株。其中ZYPA162（ST275）、ZYPA192（ST275）对FDC高水平耐药（MIC＞256 mg/L）；SRMPA3860（ST262）、SRMPA1914（ST262）和WTJH17（ST260）对FDC低水平耐药（MIC＝4 mg/L）。ZYPA162和ZYPA192来自于同一临床患者（十二指肠切除术后腹膜感染）不同时间的腹膜液样本，两者在基因组上仅存在6个SNP的差异（图1A）。

2、AFM质粒分析

5个FDC耐药株的blaAFM基因均位于IncP-2巨质粒上。

① 接合转移实验：以非常低的接合效率接合（低水平耐药株）；不可接合（高水平耐药株）。

② 质粒消除实验：消除质粒后，菌株对FDC的MIC显著降低（超过32倍）。

③ blaAFM克隆实验：回补质粒后，菌株对FDC的MIC显著升高（超过256倍）。

④ 分子对接模拟：AFM-2和FDC之间的结合自由能为-9.3 kcal/mol（图1C）。

解读：①反映质粒能不能自发水平转移；②、③确定质粒对菌株耐药性影响的大小；④表明结合体系稳定，碳青霉烯酶AFM可有效水解药物FDC。

图1 .抗生素使用史及菌株分离时间示意图；B. 质粒实验简述；C. (i)Autodock预测的FDC-AFM结合口袋，(ii)FDC-AFM结合的结构示意图；D. (i)接合转移效率对比，(ii)生物膜形成能力对比；E. (i)上下调表达水平对比，(ii) 质粒拷贝数差异，(iii)blaAFM相对表达；F. 菌株运动能力对比；G. 质粒消除前后菌株毒力对比。

3、blaAFM表达水平及拷贝数差异

① RT-qPCR和RNA-seq：高水平耐药株（ZYPA162）相比低水平耐药株（SRMPA3860）blaAFM的表达水平显著更高（p<0.001）（图1E）。

② 质粒pZYPA162的拷贝数明显高于pSRMPA3860（p<0.001）（图1E）。

由于blaAFM周围的遗传环境在所有具有相同启动子序列的质粒中是一致的，作者推测blaAFM的差异表达水平归因于质粒拷贝数变化。

4、铁载体产生与FDC耐药的关系

由于铁载体的产生会影响FDC的MIC值，本文用特殊的CAS培养基来测定铁载体的生产。

① 铁载体产量差异：ZYPA162的铁载体产量低于SRMPA3860（p<0.001）。SRMPA3860_FDC512（诱导高耐）的铁载体显著高于SRMPA3860（野生型低耐）（p<0.001）（图S2）。

② 表达水平差异：ZYPA162和SRMPA3860的TonB依赖性转运蛋白（TBDT）和铁载体的表达水平没有显著差异。SRMPA3860_FDC512相比SRMPA3860所有TBDT相关基因均显著上调（图S4）。

推测FDC压力可能会导致不同的抗性策略。

5、菌落形态与毒力变化

① 菌落形态：ZYPA162具有明显的小菌落变异（SCV）表型（图S2），但其质粒消除菌株162D表现出恢复正常的菌落形态。

② 运动能力：162D 相比ZYPA162，swarming、twitching和swimming运动能力显著提高（p<0.001）（图1F）。

③ 生物膜形成能力：162D 相比ZYPA162，生物膜形成能力显著提高（p＜0.001）（图1D）。

④ 毒力水平：大蜡螟幼虫实验显示，ZYPA162具有比162D更高的毒力（p<0.001）（图1G）。ZYPA162相比162D，III型分泌系统（T3SS）效应蛋白exoS/T/Y和exsB/C/D/E的表达水平显著较高（p<0.0001）（图S7）。

根据先前的研究，运动能力和生物膜形成能力的变化可能与lasI表达显著上调，导致Rhl群体感应系统的激活增强有关。另外，质粒pZYPA162的存在增加了T3SS效应蛋白的产生，可能因此增强了菌株的毒力。

总结

高水平头孢地尔耐药性与 IncP-2 质粒拷贝数增加导致的 blaAFM 基因过表达有关，该质粒还影响细菌的生物学特性和毒力。

图2 高水平FDC耐药铜绿假单胞菌模式图：高拷贝IncP-2巨质粒引起blaAFM过表达。高水平AFM水解进入细菌周质空间的FDC。

参考文献

Wu W, Song M, Li X, et al. High-copy IncP-2 megaplasmid carrying blaAFM in clinical difficult-to-treat resistance Pseudomonas aeruginosa: Associated with high-level cefiderocol resistance [J]. Journal of Infection, 2025, 90(2).