【唯那生物特色产品】微生物耐药专题·案例7 | 头孢他啶-阿维巴坦耐药的blaKPC-2新变体的基因组研究

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上一次我们分享的案例发现了大肠杆菌blaNDM-5和mcr-1共存的IncX3-IncX4杂合质粒，该质粒可能通过IS26和nic的两步重组形成。本次分享的内容针对治疗过程中产生的头孢他啶-阿维巴坦耐药的新型KPC肺炎克雷伯菌进行了基因组学研究。

英文标题：Multiple Novel Ceftazidime-Avibactam-Resistant Variants of bla_KPC-2-Positive Klebsiella pneumoniaein Two Patients

文章链接：10.1128/spectrum.01714-21

发表时间：2022.5

发表期刊：Microbiology Spectrum

IF：9.04

研究背景/目的：

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）在碳青霉烯耐药肠杆菌（CRE）中具有最大的比例。在中国，其耐药基因几乎全是blaKPC-2，而在一些欧美国家blaKPC-3和blaKPC-2的比例约为3:1。目前，替加环素、黏菌素和头孢他啶-阿维巴坦（CAZ/AVI）是用于治疗CRE感染的最好选择。

复旦大学附属华山医院报告了从两名患者的痰或脑脊液中分离的blaKPC-2阳性K. pneumoniae在CAZ/AVI的治疗作用下出现了多个blaKPC变体。其中blaKPC-76和blaKPC-79是首次报道。目前碳青霉烯耐药的K. pneumoniae因其高死亡率已成为严重的公共卫生问题，此研究在抗感染治疗期间发现的blaKPC快速突变，将对诊断实验室和临床实践提出了更大的挑战。

研究对象：blaKPC突变的K. pneumoniae

研究方法：全基因组测序、抗生素敏感性试验

主要研究内容及结果：

1、临床治疗方案

在CAZ/AVI治疗9天后，（女）患者1痰中K. pneumoniae携带的blaKPC-2基因突变为blaKPC-79，并在39天后突变为blaKPC-76。（男）患者2脑脊液中K. pneumoniae携带的blaKPC-2基因在治疗后的9-18天突变为blaKPC-35、blaKPC-78，而痰液中的则突变为blaKPC-33。由于CAZ/AVI耐药性的出现，在后期更改使用美罗培南进行治疗，结果blaKPC-2阳性菌株再次成为优势菌株。最终，即使使用CAZ/AVI联合碳青霉烯类药物的治疗方案，治疗仍然失败。此外，整个治疗过程中，blaKPC-33阳性K. pneumoniae，始终未从根本上消除。

(图1 含有blaKPC-2多种变体的K. pneumoniae感染患者的临床治疗和微生物学特征)

2、KPC变异情况

质粒pCQ02-121的全长48,350 bp，包含61个可预测的开放阅读框（ORF），序列分析表明，它是一个IncX3-IncX4杂合质粒。比较基因簇显示，pCQ02-121 的mcr-1及其侧翼序列可能源自pMCR1_IncX4样质粒，而blaNDM-5及其侧翼基因可能源自pNDM5_IncX3样质粒（图1a）。

该杂合质粒源于IS26和oriT的nic位点重组连接，基于质粒结构和序列分析，作者提出了两种pCQ02-121形成的模式（图1b）。在模式一中，第一步为 IS26的同源重组或转座酶介导的共整合形成，第二步为TrwC（松弛酶）催化oriT的两个同源拷贝的的分子间或分子内重组；模式二颠倒了这两步的顺序。pCQ02-121的oriT中nic位点周围的序列进一步支持了该模式（图1c）。

（图2 KPC-2及其变体的氨基酸序列和X射线晶体蛋白结构）

3、抗生素药物敏感性检测

所有菌株都对所测试的β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类和喹诺酮类抗生素高度耐药。与blaKPC-2阳性的K. pneumoniae相比，blaKPC-2变体对亚胺培南和美罗培南的MIC从≥64 mg/L降至0.25～8 mg/L，对CAZ/AVI的MIC从1～4 mg/L升至≥64 mg/L。替加环素、多黏菌素B、美罗培南-法硼巴坦和头孢吡肟-齐特巴坦对所有K. pneumoniae临床分离株均具有良好的体外活性。

表1 K. pneumoniae及其DH5α转化株、DH5α受体株的抗生素MIC

4、blaKPC基因的表达水平研究

在治疗期间，特别是在感染后期，从同一患者分离的菌株中blaKPC基因的相对表达逐渐增加。患者1的最后一个分离物中blaKPC基因的表达量可能比初始分离物高1.6倍，而患者2的基因表达量甚至可能达到5.7倍。

（图3治疗期间分离的K. pneumoniae中blaKPC基因的表达水平）

5、全基因组测序和质粒结构

根据全基因组测序（WGS）的结果，从每个患者的同一位点分离的K. pneumoniae具有99.972%至99.993%的同源性，包含多种抗生素耐药基因。其OmpK35的编码基因在第86位单核苷酸缺失后提前出现了终止密码子，而OmpK36的甘氨酸和天冬氨酸在第134位氨基酸重复。所有分离的K. pneumoniae中都出现了这种孔蛋白变化，可能是CAZ/AVI耐药的另一个原因。

患者1分离的K. pneumoniae A至D，blaKPC位于IncFII/IncR质粒pLWKPC中，其长度为148,760 bp；患者2分离的K. pneumoniae E至I，blaKPC位于IncFII/IncR型质粒pZHKPC1（脑脊液）和IncFII型质粒pZHKPC2（痰）中，长度约为105 kb，与pLWKPC相比，覆盖率为74%，同一性为99.88%。三者都包含两个多药耐药基因岛：①blaKPC和blaSHV-12；②rmtB（、blaCTX-M-65）、blaTEM-1B。耐药基因周围的多种转座子及插入序列预示着抗性基因存在潜在的快速转移能力。

(图4pLWKPC、pZHKPC1和pZHKPC2的比较质粒图谱)

文章结论

a)治疗期间产生的blaKPC-2菌株变体，来自同一时期不同位点的突变和增强耐药性的连续变异。

b) 在短期使用CAZ/AVI后，选择性压力有利于KPC-2碳青霉烯酶的变化，获得对CAZ/AVI的耐药性，并恢复了对碳青霉烯类药物的敏感性。

c) 碳青霉烯类的刺激会使KPC-2重新占据主导，导致两类药物都不能保证较好的疗效，这可能与blaKPC表达增加和ompK35、ompK36点突变有关。

d) KPC-79酶的机制可能是靠近KPC-2酶活性位点的β9折叠及其以下部分与α12螺旋连接；KPC-33、KPC-35和KPC-78酶在Ω环内出现突变，增强了头孢他啶的亲和力并降低了阿维巴坦的结合；KPC-76同时包含这两种突变。

参考文献

Qingyu Shi, Renru Han, Yan Guo, et al. Multiple Novel Ceftazidime-Avibactam-Resistant Variants of bla_KPC-2-Positive Klebsiella pneumoniaein Two Patients [J]. Microbiol Spectr, 2022, 10(3): e0171421.

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