【唯那生物特色产品】微生物耐药专题·案例8 | 弯曲杆菌CmeABC外排泵介导环丙沙星和四环素高水平耐药

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上一次我们分享的案例发现在CAZ/AVI治疗过程中肺炎克雷伯菌的blaKPC-2突变为新变体，且blaKPC-2随着更换为美罗培南治疗而重新占据优势。本次分享的内容研究的是CmeABC外排泵在耐药弯曲杆菌分离株中的表达和RAPD - PCR模式。

英文标题：Significant contribution of the CmeABC Efflux pump in high-level resistance to ciprofloxacin and tetracycline in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli clinical isolates

文章链接：10.1186/s12941-021-00439-6

发表时间：2021.5

发表期刊：Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials

IF：6.781

研究背景/目的：

弯曲杆菌属是最重要的肠道病原体之一，也是全球人类急性细菌性胃肠炎的主要原因。目前该菌已表现出对多种抗菌药物的显著抵抗能力。TetO是一种核糖体保护蛋白，其作用方式是通过抑制核糖体结合位点上的四环素替代。空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌的大环内酯耐药与染色体上gyrA基因第275位密码子的点突变有关。弯曲杆菌多药外排泵CmeABC，归属于耐外排转运蛋白的抗性小结分裂区（RND）家族，由染色体上的操纵子编码，包含三种主要蛋白质：周质融合蛋白（CmeA），内膜药物转运蛋白（CmeB）和外膜蛋白（CmeC）。本研究预探究弯曲杆菌耐药对CmeABC外排泵表达水平的影响并进行菌株的遗传相关性分析。

研究对象：腹泻儿童粪便来源的20株弯曲杆菌

研究方法：PCR、Real‑time (RT)‑PCR、Random amplified polymorphic DNA (RAPD)‑PCR、抗生素敏感性试验

研究思路：

主要研究内容及结果：

1、菌株鉴定

从腹泻儿童的283份粪便样本中获得了20株弯曲杆菌，根据马尿酸水解试验和cadF基因的双重PCR测定，分别鉴定为18个空肠弯曲杆菌和2个结肠弯曲杆菌。

(图1 a. cadF基因的双重PCR检测；b. tetO基因；c. gyrA基因)

2、耐药表型及分子特征

MIC结果显示， 17个（2个结肠弯曲杆菌和15个空肠弯曲杆菌）对四环素耐药（MIC：4–64 µg/mL），3个（15%）对四环素敏感MIC≤ 0.5 µg/mL）。对环丙沙星耐药的分离株（n=4）显示出高水平的耐药性MIC≥ 32 µg/mL。

在20个分离株中，17例（85%）检测到tetO基因，3个四环素敏感分离株中未发现tetO基因。环丙沙星耐药分离株的gyrA基因扩增和测序显示，在所有环丙沙星耐药分离株中，C257T（Thr-86-Ile）处的共同点突变为“ACA”到“ATA”。

（图2 gryA基因产物测序结果分析）

3、cmeA基因表达定量

使用RT-PCR定量评估cmeA基因的表达。结果发现四环素耐药弯曲杆菌的cmeA基因表达量明显高于四环素敏感菌株。从统计学上说，四环素抗性水平与cmeA基因表达水平呈正相关（相关系数=0.952）。此外环丙沙星耐药株cmeA基因的表达水平也明显高于敏感株，两者之间存在显著差异。

（图3 弯曲杆菌分离株中cmeA基因表达的RT-PCR分析）

4、RAPD-PCR基因分型

采用RAPD-PCR技术研究弯曲杆菌分离株的遗传多样性。根据基因分型，20株弯曲杆菌可分为9个分型（A、E、B、C、F、G、H、D、I）。

（图4 基于20株弯曲杆菌RAPD-PCR图谱的层次数值分析的树状图）

文章结论

弯曲杆菌分离株对四环素和环丙沙星的高水平耐药，是由CmeABC外排泵、质粒编码的tetO基因以及gyrA基因的点突变并行介导的。

人类样本中多药耐药弯曲杆菌分离株之间没有明确的克隆相关性或基因分型谱，表明该菌具有潜在的自治和进化能力。

参考文献

Sharifi S, Bakhshi B, Najar-Peerayeh S. Significant contribution of the CmeABC Efflux pump in high-level resistance to ciprofloxacin and tetracycline in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli clinical isolates [J]. Ann Clin Microbiol Antimicrob, 2021, 20(1): 36.

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