文献解读丨细菌新种鉴定与耐药性研究

文章题目：Scandinavium goeteborgense gen. nov.,sp.nov.,a New Member of the Family Enterobacteriaceae Isolated From a Wound Infection, Carries a Novel Quinolone Resistance Gene Variant

期刊：Frontiers in microbiology

IF：4.25

研究背景：肠杆菌科（Enterobacteriaceae）种类繁多、分布广泛，其中包含大量的人类共生菌和病原菌，基因组上常见可转移的抗生素抗性基因元件。世界卫生组织已经将肠杆菌科中具有碳青霉烯类抗生素抗性及广谱β-内酰胺酶合成特性的细菌列入第一批优先研发抗生素的病原体（2017），因此对该科中新物种的鉴定研究有助于全面了解其带来的健康风险并进行及时有效的感染防治。

研究对象：从成人伤口感染中分离出来的未知菌株（CCUG 66741），具有较高的环丙沙星抗性。

主要研究手段：细菌基因组测序

图1.文章研究思路

主要研究思路及结果：

1、耐药性表型鉴定。通过MIC实验发现CCUG 66741T对包括cefotaxime，co-trimaxozole, meropenem, tetracycline, tobramycin,以及ciprofloxacin在内的抗生素敏感，但是对ampicillin具有抗性。

2、物种鉴定（传统方法+高通量测序）

（1）MALDI-TOF分析。鉴定最近的物种是Escherichia vulneris（肠杆菌科），但其相似性也只有74.4%，低于种内阈值90%，无法确定具体种。（2）生化实验鉴定的最近物种为Buttiauxella izardii（肠杆菌科）,Enterobacter cancerogenus（肠杆菌科）（table1）。

（3）单基因鉴定。分别扩增获得16S rRNA和dnaJ基因的部分序列，进行sanger法测序。16S序列与同科4个菌株的相似性均≥98.7%（Buttiauxella ferragutiaeDSM 9390T,Buttiauxella agrestisDSM 4586T,Buttiauxellaizardii DSM9397T,Buttiauxella noackiaeDSM 9401）。dnaJ与Leclercia adecarboxylataGTC 1267相似度最高（86.3%）而基于之前的研究，在肠杆菌科中，dnaJ序列的种内差异在0-8.3%之间，因此CCUG 66741T不能归属于Leclercia adecarboxylata（14%差异）。综上，推测CCUG 66741T可能是肠杆菌科中新的分类，但无法确认。

（4）基于全基因组分析

组装水平：细菌基因组扫描图（192个contig，全长4.5Mb）

A.16S全长序列比对。CCUG 66741与肠杆菌科4个不同属的代表菌株的16S序列相似性≥98.7%；

B.16S全长DDH分析。而16S序列的DDH分析表明，CCUG 66741与代表菌株的相似性均≤25%（种内阈值70%）；

C.16S全长ANI分析。同上，CCCUG 66741T的16S序列与对应菌株的ANI值也小于80%（种内阈值95%）（TableS3）；

Table S3 16S序列相似性

D.看家基因分析。利用CCUG 66741的看家基因分析，得到与其相似的菌株包括BIGb0156和YR018，CCUG 66741与这两个菌的16S相似性为99.9%，ANI值分别为97.7%和96.04%，因此确定这三个菌属于同一个种。

E.16S序列进化分析。提取CCUG 66741及已测序的肠杆菌科30个属模式菌株（以下简称为模式菌株）的全长16S序列进行系统进化分析，结果显示与CCUG 66741最相似的属是Buttiauxella和Lelliottia（Figure1）；

F. MLSA分析。利用CCUG 66741的看家基因与肠杆菌科30个属的模式菌株进行进化分析。结果显示CCUG 66741属于一个新的分枝（与BIGb0156和YR018聚为一个cluster），因此推测其为肠杆菌科的新属（Figure 2）。

Figure1.全长16S序列进化树

Figure 2. MLSA分析

G.ANI进化分析。利用CCUG 66741与30个参考物种的ANI值做进化分析，结果显示P. gergoviae为最相似的属（Figure3）。

Figure 3. ANI进化树

H.核心基因进化分析。同样发现CCUG 66741归属于新的分枝，说明其属于新的属（Figure4）。

Figure4.核心基因进化树

3、毒力基因与抗性基因鉴定

CCUG 66741含有多个毒力因子，包括VI型分泌系统及效应因子、溶血素、毒力因子virK、cytotoxin（细胞毒素）, enterotoxin（肠毒素），说明该菌具有致病潜力，通过PathogenFinder预测，该菌可能是人类的病原菌。

在基因组中发现了qnrB基因（该基因通常不具有完全的临床耐药性）的突变体qnrB96。利用所有已知qnrB基因序列构建进化树，显示qnrB96可能是一个新的等位基因（Figure5、6）。

Figure5.qnrB基因进化树

Figure6.QnrB96蛋白序列比对

4、基因功能验证

将qnrB基因构建载体，导入大肠杆菌中，诱导表达后进行MIC实验。发现qnrB96在大肠杆菌中表达会降低菌株对ciprofloxacin（环丙沙星）的敏感性，说明了这个基因是具有耐药功能的。

关于文章结果的讨论

1、在肠杆菌科物种进化多元，常用的16s基因对种水平的系统进化研究是无效的。CCUG 66741的16S序列与不同属的相似性高达98.8%，无法确定其种属，而通过全基因组分析（MLSA、核心基因组分析）鉴定其为一个新属。

2、全基因组测序是对临床病原菌进行检测和鉴定的有效手段，对肠杆菌科物种的分类进化研究也具有重要作用。在本次研究中，16S序列比对相近的物种，DDH和ANI分析的值均低于种内阈值，说明其是一个新物种，对已发表各属的模式菌株的全基因组进行比对，其结果与MLSA和ANI一样，CCUG 66741属于一个新属。

3、与传统的基于单基因的菌株分型方法相比，基于全基因组的方法具有更高的分辨率和可靠性，此外，还有效避免了由于基因水平转移而导致的错误结论。

4、在本次研究中，MLSA进化分析、ANI进化分析以及基于核心基因组的进化分析都表明CCUG 66741与另外两个菌株（BIGb0156 andYR018）共同形成了一个新的分枝，因此推断CCUG 66741是肠杆菌科的一个新属。

参考文献

Marathe N, Salvà-Serra F, Karlsson R, et al.Scandinavium goeteborgensegen. nov., sp. nov., a new member of the familyEnterobacteriaceaeisolated from a wound infection, carries a novel quinolone-resistance gene variant[J]. Frontiers in microbiology, 2019, 10: 2511.

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