MLST常见问题及解答

在理想情况下，MLST 预测结果通常应清晰包含 7 个参考基因座（locus）的等位基因编号（allele），以及由该等位基因谱（profile）对应的 ST 型编号。

以肺炎克雷伯菌模式菌株 HS11286 为例，其预测结果如下图所示：7 个等位基因编号明确，ST 型判定为 ST11。这是最标准的输出结果。

但在实际分析中，预测结果可能不一定会这么顺利。下面针对MLST的常见典型问题，分别进行说明。

Question1：预测结果没有ST型，是哪里出了问题？

未预测到ST型，主要可分为以下两类情形：

1）7个管家基因均能成功比对到相应的等位基因编号，但它们的组合所对应的ST型在数据库中尚无记录，新等位基因谱（new profile）。

2）新等位基因（new allele）：即1个或多个管家基因的序列无法与已知等位基因匹配，属于新出现的突变类型，因此其ST型必然也为新型。

* 特殊情况-基因断裂：在组装结果中，若某个locus发生断裂，位于contig/scaffold的末端，则同样无法获得等位基因编号。该情况多见于二代扫描图测序，需根据实际数据判断是否可通过人工方式将断裂片段连接。

针对上述情况，建议将相关数据提交至对应的MLST分型数据库（例如肺炎克雷伯菌可提交至BIGSdb-Pasteur），以获得正式的新allele编号和新ST编号。

Question2：如何申请新allele和新ST？

1、首先根据研究的物种选择合适的分型提交数据库；

2、然后注册个人账号，注册菌株和分型数据库；

3、接着从样本中截取allele序列，申请新allele编号（如果没有新allele忽略这一步）；

4、最后基于数据库对物种的提交需求，准备等位基因谱和样本信息表，申请新ST编号。

详细提交方法可参考密码子学院课程《微生物分子分型-MLST》进行系统学习（https://college.mimazi.net/course/article-6.html）。

Question3：不申请新ST型对分析结果有何影响？

1）对系统发育树（进化树）的影响：影响较小，可使用“unknown”作为新ST型的注释，但建议申请新ST型。

2）对最小生成树的影响（分情况讨论）：

若等位基因谱明确：影响较小，因为最小生成树依赖于基因座编号，可使用“unknown”作为新ST型的注释，但建议申请新ST型；

若存在新allele：影响较大，相关菌株不适合纳入最小生成树分析，通常需要剔除菌株，因此，强烈建议优先完成新allele和新ST申请，再开展正式分析。

Question4：如果没有现成的MLST分型方案，应该怎么办？

并非所有物种都已在数据库中建立MLST分型方案，尤其是一些研究相对较少、较为冷门的物种。这种情况下，可以选择分辨率更高的已存在cgMLST方案作为替代；若cgMLST方案也不存在，可以自行根据核心基因建立一套cgMLST方案。

另外需要注意，某些属内的物种共用一套分型方案，比如K. pneumoniae species complex，包括K. pneumoniae、K. quasipneumoniae、K. variicola等，这些物种之间通常亲缘关系密切，遗传差异较小。

Question5：一个物种有多套MLST分型方案，都可以用吗？

都可以用，但通常情况下，优先选择使用更广泛，更主流的分型方案。

以鲍曼不动杆菌为例，它有Oxford scheme和Pasteur scheme两套MLST分型方案，两者均含有7个管家基因，其中3个基因（cpn60、gltA、recA）是共有的，但其余基因位点不同，Pasteur scheme更为常用。而埃希氏菌同样存在Achtman scheme和Pasteur scheme两套分型方案，但Achtman scheme含有7个管家基因，而Pasteur scheme含有8个，且两者的基因位点几乎均不相同，Achtman scheme更为常用。

另外需要注意同一项分析中建议仅使用其中一套方案，保持前后结果一致，并标注具体使用了哪一套方案，不同方案的ST编号不能直接比较。

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细菌SNP距离矩阵和系统发育树构（MINTyper）：http://cloud2.mimazi.net:9001/tool/article-194.html

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