文章解读丨碳青霉烯耐药的高毒ST11肺炎克雷伯菌的流行病学研究

文章题目：A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study

文章链接;10.1016/ S1473-3099(17)30489-9

发表时间：2018.1

期刊：Lancet Infect Dis

IF：71.421

研究背景/目的：肺炎克雷伯菌可在免疫功能低下的患者中引起侵入性医院获得性感染。而高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）能够在年轻和健康个体中引起社区获得性感染，如肝脓肿、肺炎、脑膜炎和眼内炎，因此与高发病率和死亡率相关。到目前为止，大多数高毒力肺炎克雷伯菌都是K1或K2型，并且对抗生素敏感。但在本研究中，作者发现了一种新型的ST11碳青霉烯耐药的高毒肺炎克雷伯菌。

研究对象：VITEK-2、接合转移、PFGE、S1-PFGE、拉丝实验、人中性粒细胞检测、蜡螟幼虫感染试验、全基因组测序、PCR

说明：

ST11是CRKP的常见序列分型，因此作者认为本研究中耐药合并高毒的菌株是在耐药株的基础上捕获毒力质粒的结果。本文仅对K. pneumoniae 4进行了三代测序，其它菌株为二代测序。

主要研究思路及结果：

1、患者与菌株来源

该研究的CRKP来自于5例患者的血液、痰液或粪便样本。共计检出21株非重复菌株。这些菌株的抗生素敏感性相似，属于ST11，并具有高度相似的PFGE模式。

（图1:肺炎克雷伯菌暴发病例的流行病学）

2、K. pneumoniae序列分型与药敏结果

作者从每个患者中选择一个具有代表性的CRKP作进一步研究。结果发现这5个菌株的blaKPC-2、blaCTX-M-65和blaTEM-1基因可转移到大肠埃希菌EC600中，表现为碳青霉烯类和头孢菌素类耐药。MLST分析显示，它们属于ST11，血清型为K47 (wzi 209)。SNP分析显示，它们的核心基因组仅存在少数SNPs差异(n≤4)，这表明这些菌株起源于单个克隆。

3、ST11 K. pneumoniae毒力研究

与先前的报道相比，此次患者肺炎更严重，死亡率更高，推测这些菌株具有更强的毒力，因此对作者对5个CRKP的毒力展开了研究。

拉丝实验显示5个菌株均为阳性（>20 mm）。人中性粒细胞检测显示研究菌株CRKP 4和5存活率极高。蜡螟幼虫感染试验显示研究菌株CRKP 1-5毒力高于传统hvKp 91和1088。

与K1 hvKp相比，ST11型的K. pneumoniae具有一些独特的毒力基因，如iroBCDN、iucABCD、rmpA和rmpA2等，且它们位于pLVPK样的质粒上。ST11型hvKp（包括本研究的5株菌）相较于普通ST11型K. pneumoniae主要缺少了iuc家族基因和rmpA2基因。

这些结果意味着5个ST11 K. pneumoniae菌株为CR-hvKp。

图2 K. pneumoniae菌株的人中性粒细胞检测（左上）

图3 K. pneumoniae菌株在蜡螟感染模型中的毒力潜力（左下）

图4 K. pneumoniae菌株毒力基因分析（右）

序列比对结果显示，5株ST11 CR-hvKp携带的质粒均与pLVPK质粒的大部分区域（包括rmpA2、iucABCD-iutA）高度相似，但缺少一段约50 kbp的区域（包括rmpA和iroBCDN）。Southern杂交证实这5个菌株中都存在大约170 kbp的毒力质粒。

其中K. pneumoniae 4进行了三代测序，它的毒力质粒pVir-CR-HvKP4为IncHI1B/ IncFIB型，长度178,154 bp，平均GC含量50.5%。同时该菌株还具有携带blaKPC-2的质粒pKPC-CR-HvKP4。

为了测试该毒力质粒是否利于ST11 CR-hvKp的高毒力表型，作者使用质粒固化方法去除了毒力质粒pVir-CR-HvKP4，以产生菌株PC K. pneumoniae 4。拉丝实验、人中性粒细胞检测和蜡螟幼虫感染试验支持了该结果。

图5 A. K. pneumoniae毒力质粒基因图谱

B. S1-PFGE和rmpA2标记基因的Southern杂交

作者还回顾性筛选了387株临床ST11 CRKP，11株(3%)携带毒力质粒。其中9株菌株含有额外的毒力基因rmpA和iroN，推测可能含有全长的毒力质粒pLVPK。

文章结论

1、CRKP可以通过获得外源的pLVPK样毒力质粒表现出高毒力。

2、pLVPK样质粒对hvKp毒力具有重要意义，其毒力主要来源于prmpA2、iucABCD-iutA区，而rmpA和iroBCDN区影响有限。

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