携带多个接合质粒的XDR铜绿假单胞菌ST664克隆的分子遗传分析

文章标题：Molecular genetic analysis of an XDR Pseudomonas aeruginosa ST664 clone carrying multiple conjugal plasmids

文章链接：doi: 10.1093/jac/dkaa063

发表时间：2020.6

发表期刊：J Antimicrob Chemother

IF：5.2

研究背景：KPC是一种可水解碳青霉烯类抗生素的水解酶，在肺炎克雷伯菌中最为普遍，但其他肠杆菌(如大肠杆菌)和非发酵菌(如假单胞菌或不动杆菌)中也有报道。质粒是介导抗生素转移的关键载体，有些质粒可以自发进行接合转移，称为接合性质粒，有些需要其它质粒编码的（IV型分泌系统）T4SS或者松弛酶、IV型伴侣蛋白（T4CP）来协助转移，称为可移动质粒。然而在细胞内可以稳定共存的不同质粒的数量和类型受到质粒不相容（Inc型）的限制。

研究对象：泛耐药（XDR）的ST664铜绿假单胞菌

研究方法：抗菌药物敏感性试验、PFGE、MLST、S1-PFGE、PCR、接合转移、全基因组测序

主要研究内容及结果：

1. 菌株来源和药敏试验

本研究收集了21株XDR铜绿假单胞菌，来自于烧伤感染患者。药敏结果显示这些分离株具有类似的耐药谱(表1)，对多种类型的抗生素表现出耐药性，包括氨基糖苷类(庆大霉素和妥布霉素)、头孢菌素类(头孢吡肟、头孢替坦和头孢他啶)、碳青霉烯类(亚胺培南和美罗培南)和氟喹诺酮类(环丙沙星和左氧氟沙星)，但对阿米卡星和多黏菌素B敏感。PFGE聚类分析将分离株主要划分为两种克隆型(判定标准:相似度95%)，76%(16/21)的分离株属于A型，24%(5/21)属于B型(图1)。MLST显示所有分离株具有相同的ST，即ST664(图1)。

图1 21株XDR铜绿假单胞菌PFGE图谱。*表示WGS的分离株。BICU代表烧伤重症监护室

表1 ST664 XDR铜绿假单胞菌克隆的药敏结果

1. KPC-2阳性菌株NK546质粒分析

复制子与转移模块

本研究发现的pNK546a携带KPC-2型碳青霉烯酶，它与两种已报道的耐药大质粒pOZ176（携带IMP-9）和pJB37（携带VIM-2）高度相关。质粒维持区的比较分析表明，pNK546a的维持性质与pOZ176和pJB37的维持性质明显不同。根据复制起始蛋白RepA的氨基酸序列同源性，pOZ176和pJB37都属于质粒不相容群IncP-2，这是铜绿假单胞菌临床分离株中最常见的质粒类型之一，通常大小为>300 kb。然而，pNK546a中没有检测到IncP-2复制子区（rep-par），而是发现了一个与荧光假单胞菌SBW25 IncP-3质粒pQBR103的RepA具有81%氨基酸覆盖率和52%序列相似性的RepA。其分割蛋白ParA和ParB与pQBR103的分割蛋白具有54%至63%的相似性。考虑到pNK546a与pQBR103具有相似的复制子区和分割蛋白，作者将pNK546a分类为IncP-3样质粒。pJB37和pOZ176都是接合质粒，在假单胞菌物种之间可以自主传播，这与它们接合转移区（traF、traG、virD2和trbBCDEJLFGI基因）的存在是相关的。但pNK546a没有发现接合转移区。

抗生素耐药基因与移动元件

pNK546a的bla_KPC-2基因位于一个11kb的可移动遗传元件“IS6100-ISKpn27-bla_KPC-2-ΔISKpn6-Tn1403”上，该元件已在质粒p14057-KPC中发现，如图1(b)所示，ΔTn3:ISKpn27至ΔrepB区域代表了核心的bla_KPC-2platform，其两侧分别是IS6100的转座酶以及Tn1403的解离酶和转座酶。有趣的是，该菌株中的另一个质粒pNK546c与p14057-KPC也具有很高的相似性，且不包含11 kb的bla_KPC-2所在区域。此外，质粒pNK546c携带一组完整的接合转移基因（traI-mobC-traML-ssb-topB-virD4-virBs），与p14057KPC中描述的相似，因此它可能进行自主传播。

pNK546a的其他三个AMR基因聚类在一个10kb的Tn3-aadB-cmlA1-sul1-TniBA遗传元件，并插入到Tn5041-汞抗性转座子骨架中，该结构通常位于1类整合子。BLAST分析显示，pNK546b也有一段类似的结构“Tn5041-Tn3-aadB-cmlA1-sul1-TniBA-mers-czcs-Tn4652遗传元件，其核苷酸同一性为99.9%。pNK546b包含复制/分配区以及接合转移系统（由TraDLEKBVCW基因组成）（图2a），包括膜结合的转运通道（TraLEKBVW）、主要ATP酶（TraC）和IV型偶联蛋白（TraD），表明它是一种接合性质粒。

质粒的移动性分析

为了测试携带bla_KPC-2的巨型质粒pNK546a是否能够自主转移到敏感菌株中，作者使用铜绿假单胞菌PAO1的多黏菌素B抗性突变体作为受体，分离株NK546作为供体进行接合试验。通过PCR检测pNK546a的bla_KPC-2基因，证实质粒pNK546a成功接合到PAO1中。通过管家基因acsA等位基因测序，所有接合子被鉴定为PAO1菌株。另外，与PAO1相比，bla_KPC-2阳性接合子（PAO1/pNK546a）的碳青霉烯和头孢他啶的MICs增加了16至32倍。有趣的是，大多数bla_KPC-2接合子也携带pNK546b，但不携带pNK546c，这说明pNK546b经常随着pNK546a转移到敏感菌株中。

在随机挑选的六个庆大霉素耐药的转化接合子中（庆大霉素耐药基因aadB存在于pNK546a和pNK546b上），有五个是aadB阳性的（5号为假阳性），且其中一个pNK546a和pNK546b都为阳性，再次显示了巨型质粒pNK546a和pNK546b的协同转移发生率很高（20％）。

此外，在使用仅含有pNK546a质粒的供体菌株进行测试时，发现pNK546a的接合转移不成功，表明大质粒pNK546a不能自主传播。这与序列分析结果一致。

文章推论

根据ST664克隆三种共存质粒的基因组情况和接合转移结果，作者认为这些质粒之间可能存在以下5种遗传事件：

(i) pNK546a巨质粒中IncP-2复制区(rep-par基因)和接合转移区(tra基因)的丢失。

(ii) pNK546a和pNK546b之间存在Tn5041-Tn4652介导的mer-aadB-cmlA1-sul1-czc基因簇的拷贝；

(iii) Tn1430-IS6100介导bla_KPC-2基因从pNK546c转座到pNK546a；

(iv)某些ST664分离株中pNK546c的丢失；

(v)接合质粒pNK546a和pNK546b协同转移。

参考文献

Bai F, Yang L, Wu W, et al. Molecular genetic analysis of an XDR Pseudomonas aeruginosa ST664 clone carrying multiple conjugal plasmids [J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2020, 75(6): 1443-52.

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