【文献速递】医院污水中产TMexCD-TOprJ的耐碳青霉烯类革兰阴性菌的鉴定

【据《Drug Resistance Updates》2023年9月报道】题：医院污水中产TMexCD-TOprJ的耐碳青霉烯类革兰阴性菌的鉴定

【背景】

替加环素是治疗耐碳青霉烯类革兰阴性菌( CR-GNB )感染的重要药物。替加环素耐药的机制涉及染色体外排泵的过表达、药物结合位点的突变以及质粒介导的替加环素耐药基因tet(X3)和tet(X4) 的酶失活。2020年，一种新的质粒编码的抗药小结分裂区 ( RND )外排泵基因簇tmexCD-toprJ被发现可以降低替加环素的敏感性。在来自中国和越南的克雷伯氏菌属、解鸟氨酸拉乌尔菌和奇异变形杆菌中检测到多种同源变体( tmexC1D1-toprJ1 , tmexC2D2-toprJ2和tmexC3D3-toprJ1b)。tmex CD-topr J与碳青霉烯类或黏菌素耐药基因在临床分离株中共存的现象已有报道。

【结果】

医院污水是细菌耐药基因传播和进化的重要储库。为了解苏州大学附属第二医院污水中耐碳青霉烯类和tmex CD-topr J阳性GNB的基因特征，于2019年7月采集医院各科室污水池和下水道衬管水样。首先，使用含2 mg/L美罗培南的LB琼脂筛选CR-GNB，共检测到84株CR-GNB。然后使用引物tmex-F和tmex-R对tmexCD-toprJ基因簇进行PCR筛选。在84株CR-GNB中，鉴定出5株产TMexCD-toprJ的CR-GNB (TMCR-GNB)，分别为HD6421、HD6422、HD6429、HD6515和HD6516 (表1)。

对5株TMCR-GNB分离株进行种属鉴定以及二代测序，结果表明，HD6429属于解鸟氨酸拉乌尔菌，其余4株菌属于假单胞菌属，其中HD6515和HD6516分别为P. hunanensis和P. monteilii (ANI>95%)。另外2株菌HD6421和HD6422均来自未鉴定的假单胞菌(P. hunanensis和P. monteilii的ANI约为85%) (表1)。假单胞菌属和解鸟氨酸拉乌尔菌普遍存在于水环境中，是潜在的耐药基因的储存库。采用微量肉汤稀释法进行药敏试验，结果显示 (表1)，5株分离菌对包括美罗培南(16~32 mg/L)、亚胺培南(8~32mg/L)、庆大霉素(4~32mg/L)和替加环素(1~4mg/L)在内的多种抗生素均耐药或敏感性降低。对5株TMCR-GNB进行获得性耐药基因(ARGs)鉴定，发现5株TMCR-GNB均含有多种ARGs (图S1A)。

其中，HD6421和HD6422均含有两份bla_IMP-1，而HD6515和HD6516均含有1份bla_VIM-2,Hd6429同时含有bla_NDM-1和bla_IMP-4。这是首次报道解鸟氨酸拉乌尔菌同时产NDM-1和IMP-4碳青霉烯酶。通过序列比对，将5株TMCR-GNB携带的tmex CD-toprJ基因簇分为4个不同的亚型。HD6429中该基因簇的氨基酸序列与tmexC2D2-toprJ2匹配。HD6421和HD6422的tmexC与tmexC3具有100%的氨基酸序列一致性，HD6515和HD6516的tmexC分别与TMexC3和TMexC3.2的氨基酸序列具有99.74%和100%的一致性。HD6421、HD6422和HD6516的TMexD与TMexD3相同。在HD6515中，与TMexD3和TMexD3.2相比，TMexD蛋白有2个氨基酸替换，分别为V56Q、T167A和V56Q、M113K。在本研究中，我们将HD6515中的tmexD指定为tmexD3.3。TMexD样蛋白的系统发育分析表明，大多数基因位于假单胞菌属的分支上，表明假单胞菌属可能是这些抗菌药物抗性簇的祖先(图S1B)。

HD6515和HD6516中的toprJ样基因与toprJ1相比携带单个同义突变，因此将其命名为toprJ1b。toprJ与toprJ1b相比，HD6421和HD6422中的核苷酸序列有15个碱基对缺失，因此我们将HD6421和HD6422中的toprJ称为toprJ3。为了评估这些tmexCD-toprJ变体对替加环素耐药性的影响，构建了重组质粒，即pUC18-tmexC2D2-toprJ2，pUC18-tmexC3D3-toprJ3，pUC18-tmexC3.2D3-toprJ1b 和Puc18-Tmexc3.2D3.3-Toprj1B。这些重组菌株表现出比空载体菌株更高的替加环素的MIC值(增加2~4倍)。与DH5α-pUC18相比，表达pUC18- tmexC3.2D3-toprJ1b的DH5α对替加环素的MIC提高了4倍。这些结果表明，鉴定出的tmexCD-toprJ变异体可介导替加环素MIC的增加，其进化可导致更高水平的替加环素耐药性的产生。 为了探究其遗传特征，对菌株HD6422、HD6429、HD6515和HD6516进行了纳米微滴长读段测序。在5株TMCR-GNB中，发现tnfxB-tmexCD-toprJ簇位于Tn6855变体或Tn6855相关区域内(图1D)。Tn6855是一个整合和移动元件(IME)的原型，包括attL/R (附着点在左/右端)、2个假定的位点特异性整合酶基因(int1和int2)、4个假定蛋白基因和nfxB-mexCD-toprJ簇。与Tn6855相比，5个TMCR-GNB中的Tn6855变体均存在一定的辅助性元件。例如，在HD6429的tnfx B2基因内插入IS5家族元件ISRor5，在HD6421、HD6422和HD6515的tnxf B3基因下游插入IS1182家族元件ISCfr1。所有这些Tn6855变异体都插入在相同的umuC样基因中。Tn6855和Tn6855变体主要存在于假单胞菌属中染色体和解鸟氨酸拉乌尔菌质粒，但Tn6855传播的潜在机制仍不清楚。

HD6422含有1条染色体(5,376，672bp)和1个质粒pHD6422 (479，108bp)。通过基因组分析，将连续克隆系定位到pHD6422上，从而扩展了pHD6421的全长基因组，得到了474，947bp的质粒序列(pHD6421)。两个质粒pHD6421和pHD6422几乎完全相同，都属于IncpJBCL41型。对GenBank数据库进行质粒BLAST查询，发现pHD6422与质粒pVIM-24-ZDHY316 (CP064945.1)、pVIM-24-ZDHY414 (CP064948.1)、pZXPA-20-602k (CP061724.1)、pNY5709-IMP(MN961670.1)和pJBCL41(MK496050.1)亲缘关系较近(图1A)。这些质粒均来源于假单胞菌属，表明该菌是IncpJBCL41型质粒的共同宿主。此外，在pHD6422中发现两个拷贝的bla_IMP-1与tmexD3-toprJ3共存。在pHD6421和pHD6422中没有检测到接合转移系统，这可能是它们在接合转移实验中不能成功转入大肠杆菌J53和铜绿假单胞菌PAO1的原因。

HD6515和HD6516的基因组序列显示存在一条长度分别为6，290，791bp和5，974，325bp的染色体，以及一个质粒pHD6515(375，)的一个质粒共享主链和复制基因repAIncpSTY(图1C)。此外，IncpSTY型质粒pHD6516是一个携带tmexC3.2D3-toprJ1b的新型不相容基因，表明tmexCD-toprJ可能由IncpSTY型质粒获得。此外，tmexC3.2D3.3-toprJ1b基因簇位于HD6515染色体上。在pHD6516中发现接合转移基因，该质粒能够通过接合转移到铜绿假单胞菌PAO1中。HD6516的接合频率为每个受体细胞10^-4个。然而，在转接合子PAO1-pHD6516中观察到的替加环素MIC没有显著差异，表明尽管携带tmexCD-toprJ基因簇，该质粒对天然耐药PAO1的替加环素耐药性影响很小。

HD6429含有1条染色体(5，593，369bp)和6个质粒[pHD6429-1(380，441 bp)、pHD6429-2(54,035bp)、pHD6429-3(142，633bp)、pHD6429-4(130，176 bp)、pHD6429-5(8645bp)和pHD6429-6(4214bp)]。bla_NDM-1基因位于IncX3型质粒pHD6429-2上。1株IncHI群质粒pHD6429-1携带tmexC2D2-toprJ2基因簇和金属β-内酰胺酶基因(bla_IMP-4)，该基因在In2146中被发现。BLASTn分析发现3株人源IncHI质粒(pJNQH473-3，pJNQH491-2和pJNQH579-2)与pHD6429-1骨架相似，均含有tmexC2D2-toprJ2，但3株质粒均不含bla_IMP-4 (图1B)。所有质粒均携带2个复制基因(repHI5B和repFIB样)，并与IncHI5参考质粒pA324-IMP(MF344566)的骨架序列同源性均在90%以上。接合转移实验表明，pHD6429-1在22℃条件下能成功转入大肠杆菌J53中，而在37℃条件下则失败，说明Inc HI5型质粒更可能来源于环境而非人类。然而，从医院污水和人类中鉴定出高度相似的产TMexC2D2TOprJ2的IncHI5型质粒，表明环境和人类之间通过接合质粒进行水平基因转移的可能性。

【结论】

本研究从医院污水中分离出5株TMCR-GNB，分别属于假单胞菌属和解鸟氨酸拉链菌属。这5株分离菌均携带至少一种碳青霉烯类耐药基因，且均为多重耐药。遗传分析揭示了这些分离物之间具有高度的基因组多样性。实验检测到多个tmexCD-toprJ簇，tmexC3.2D3-toprJ1b的基因结构显示出比其他三个变体高2倍的替加环素最低抑菌浓度(MIC)。此外，tmexCD-toprJ基因簇起源于假单胞菌属，其主要定位于染色体和质粒上相同umuC样基因插入的Tn6855变体上。其与bla_IMP或bla_VIM共定位于5株TMCR-GNB的IncHI5-、IncpJBCL41-和IncpSTY-型质粒上。IncHI5-和IncpSTY-型质粒具有接合转移到大肠杆菌J53和铜绿假单胞菌PAO1的能力。在人类样本中也检测到类似的携带tmexCD-toprJ的IncHI5质粒，这表明在环境和人类之间存在传播。医院污水中TMCR-GNB的出现强调了需要加强对医院污水中抗菌药物耐药性的监测。