文献解读 | 2010-2022年中国铜绿假单胞菌头孢他啶-阿维巴坦高水平耐药机制研究

文章题目：Genomic epidemiology and ceftazidime-avibactam high-level resistance mechanisms of Pseudomonas aeruginosa in China from 2010 to 2022

文章链接：doi: 10.1080/22221751.2024.2324068

发表时间：2024.12

发表期刊：Emerg Microbes Infect

影响因子：8.4

概述

该研究通过对2010至2022年间在我国收集的5763株铜绿假单胞菌进行分析，探讨了这些菌株对头孢他啶-阿维巴坦（CZA）高度耐药的机制。研究发现，有56株产生PER酶的菌株，其中大部分为难治性耐药铜绿假单胞将军（DTR-PA）菌株，且多数对CZA表现出耐药性。blaPER-1和blaPER-4基因的过表达导致CZA的最低抑菌浓度（MIC）分别增加了16倍和>1024倍。通过全基因组测序发现，blaPER-1基因位于两种不同的IncP-2型质粒和染色体上，而blaPER-4基因仅存在于染色体上，且由一个1类整合酶嵌入Tn6485-like转座子中。研究还发现，PER-1阳性菌株的过表达外排泵可能与CZA高度耐药相关。此外，PER-4对阿维巴坦的亲和力较低，和PER-1相比，它对头孢他啶的催化效率相似，但对阿维巴坦的IC50值高出约3359倍。研究结果表明，PER-1的过表达结合外排泵活性增强以及PER-4对阿维巴坦的低亲和力，共同导致了CZA的高度耐药性。Tn6485-like转座子在blaPER基因的传播中起到重要作用。因此，需要加强监控，以防止DTR-PA菌株中CZA高度耐药性的进一步传播。

结果

1、产PER菌株的抗菌药物敏感性

在5763 株铜绿假单胞菌分离株中鉴定出 56 株产 PER 酶的菌株（0.97%，56/5763），其中50 株携带 blaPER-1 ，6 株携带 blaPER-4。所有产 PER 酶的56个菌株都对头孢他啶、头孢吡肟和氨曲南耐药，但对多黏菌素敏感。大多数产 PER 酶的菌株表现出对亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、环丙沙星、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、左氧氟沙星和头孢他啶/阿维巴坦耐药（表1）。其中产 PER 酶菌株CZA的耐药率为76.79%，且14.3% 具有高 MIC 值 （>512 μg/mL）。82.1% 的产 PER 酶菌株被归类为难治性铜绿假单胞菌 （DTR-PA）。

2、分子流行病学

core SNP系统发育树显示，56 株产 PER 酶菌株分为 19 个不同的序列类型 (ST)。其中ST244、ST298 和 ST235 是最常见的 ST 类型，也是全球十大高风险克隆之一。产 PER-4 菌株都属于 ST235 克隆谱系。

图1 携带blaPER的铜绿假单胞菌分离株的系统发育树

3、blaPER-1和blaPER-4的过表达是CZA抗性表型的原因

将 blaPER-1 和 blaPER-4基因克隆到PAO1中表达，结果显示，与野生型菌株相比，携带 blaPER-1 和 blaPER-4 的菌株对头孢他啶/阿维巴坦的 MIC 值分别增加了 16 倍和 >1024 倍。在 CZA 高水平耐药菌株中，blaPER-1的表达水平显著高于 CZA 敏感菌株。

对照株PAO1； 野生型PAO1-pGK1900；实验株PAO1/pGK-1900-PER-1和PAO1/pGJ-1900-PER-4。

图S2 blaPER-1表达的相对比率

4、blaPER-1和blaPER-4的遗传背景

blaPER-1 基因位于染色体（n=8）和两种不同类型的 IncP-2 质粒中（n=42）。接合实验显示两种不同质粒类型的产PER-1的分离株可以将其抗性基因转移到受体菌株上，1型质粒n=4）仅由ST132克隆携带，2型质粒（n=38）存在于各种ST菌株中。blaPER-1主要存在于Tn6485-like多重耐药（MDR）复合转座子内。

blaPER-4 基因仅位于染色体的ISCR1-blaPER-4元件中，且从结构上看，blaPER-4也位于一个Tn6485-like的MDR转座子内。

图3 A. 产PER-1质粒pPA272和其他质粒的比较分析；

B. pPA272、pPA1045、PA2818和PA2209中blaPER-1的遗传背景比较。

图4 A.分离株blaPER-4 contig对齐；B. blaPER-4遗传背景比较

5、外排泵的过度表达与CZA耐药性有关

三个产PER-1的PA分离物对CZA表现出高水平的抗性，但它们的转化子（transformants）仅表现出较低的CZA抗性，这说明CZA 的高水平耐药可能有其它因素的影响。实验结果显示，在CZA高水平耐药分离株中，mexA、mexE和mexY的表达显著增加，这意味着MexAB-OprM、MexEF-OprN和MexXY-OprM外排泵可能与CZA的高水平耐药有关。

图2 外排泵和blaPER-1表达的相对比率

6、酶动力学数据

野生型PER-1酶 和 PER-4酶 对头孢他啶的 kcat/Km 值相似，但 PER-4 对阿维巴坦（约3359倍）、他唑巴坦（约3002倍）和克拉维酸（5.6倍）的 IC50 值均比 PER-1 要高，这意味着产PER-4的菌株对β-内酰胺酶抑制剂类药物有极高的抗性。

7、PER-1 和 PER-4 的配体结合能力结构比较

基于PER-1已知晶体结构，作者构建了 PER-1 和 PER-4 的同源模型，并用MM/GBSA评分对 β-内酰胺类抗生素和抑制剂进行了共价对接。结构分析表明，PER-4 对头孢菌素和单环β-内酰胺的水解能力略弱于 PER-1，对克拉维酸抑制的敏感型低于 PER-1。然而，PER-4 对阿维巴坦和他唑巴坦的抑制表现出很强的抗性。

图S4 A. PER-1、PER-4与β-内酰胺类药物的结合比较

图S4 B. PER-1、PER-4与抑制剂的结合比较

8、blaPER 的适应性效应

生长曲线结果显示，blaPER 基因对细菌的适应性没有负面影响，但与 blaPER-1 相比， 携带blaPER-4 基因的细菌生长速度会略低一些。

图S5 生长曲线（A）、相对生长率（B）和生长曲线下面积（C）

结论

1、铜绿假单胞菌的CZA高水平耐药性是blaPER-1过表达、外排泵活性增强和blaPER-4 对阿维巴坦低亲和力共同作用的结果。

2、blaPER 基因由可移动遗传元件 ISCR1-blaPER携带，并整合到复杂的 I 类整合子中，通常位于Tn6485-like的MDR转座子内，这可能导致高水平CZA耐药性的进一步传播。

参考文献

Li X, Zhou L, Lei T, et al. Genomic epidemiology and ceftazidime-avibactam high-level resistance mechanisms of Pseudomonas aeruginosa in China from 2010 to 2022 [J]. Emerging Microbes & Infections, 2024, 13(1).