文献解读 | 肺炎克雷伯菌mcr-8遗传背景的异质性和多样性

文章标题：Heterogeneity and Diversity of mcr-8 Genetic Context in Chicken-Associated Klebsiella pneumoniae

文章链接：10.1128/AAC.01872-20

发表时间：2020.12

发表期刊：Antimicrob Agents Chemother

IF：4.9

研究背景：由mcr基因家族所介导的可移动的黏菌素耐药性在肠杆菌科中的大量出现已成为全球关注的问题。最近的研究表明，mcr-8出现在肺炎克雷伯菌及其密切相关的物种（K. quasipneumoniae和Raoultella ornithinolytica）中，这可能有助于黏菌素耐药性在这些物种之间的水平传播。然而，肺炎克雷伯菌分离株中mcr-8的分子遗传背景和流行情况的信息仍然较少。因此，本研究旨在调查mcr-8的流行性和遗传特征，并研究其在黏菌素耐药中的作用。

研究对象：mcr-8.1阳性的肺炎克雷伯菌

研究方法：全基因组测序、药物敏感性检测、PCR鉴定、S1-PFGE and Southern blotting、接合实验、质粒消除实验、MLST、贝叶斯分型、cgSNP系统发育分析、比较基因簇分析、氨基酸序列突变分析

主要研究内容及结果：

1. 菌株基本信息、mcr阳性菌筛选及药敏试验

研究者从300只鸡的泄殖腔中分离了122株肺炎克雷伯菌，PCR结果显示12株菌（9.83%）携带mcr-8基因，6株菌（4.92%）携带mcr-1基因，未发现其他mcr基因。所有mcr-8阳性菌株的黏菌素和多黏菌素B的最低抑菌浓度（MIC）在4 ~ 128 μg/ml，其中KP4、KP49、KP700和KP744菌株对黏菌素的MIC均超过32 μg/ml，而由于mcr基因通常仅介导低水平的黏菌素耐药，因此这些菌株除mcr-8外可能还含有其他黏菌素耐药机制。

1. mcr-8基因定位、接合转移实验

S1-PFGE和Southern blotting实验结果显示所有菌株的mcr-8基因都位于质粒上，大小在60 ~ 250 kb之间。接合实验表明，所有含有mcr-8的质粒都能以10-6 ~ 10-8的频率从肺炎克雷伯菌分离株转移至大肠杆菌J53受体菌，并导致所有转化接合子的黏菌素的耐药水平增加2 ~ 32倍。

1. mcr-8基因的遗传环境分析

作者对12株含mcr-8基因的肺炎克雷伯菌进行了基因组测序。质粒复制子分析表明，除pKP22为含有IncA和IncC的大型杂交质粒外，其余质粒均与IncFIA或IncFIIK复制子相关。

pKP22、pKP12、pKP4、pKP3和pKP744的mcr-8.1基因遗传环境较为相似，主要由“IS903B-orf-mcr-8.1-orf-IS903B”组成。而pKP49和pKP700的mcr-8.1基因遗传背景则是“ISEcl1-mcr-8.1-orf-ISKpn26”，与其它菌株的mcr-8.1携带质粒的情况明显不同。因此根据序列的同源性，质粒被分为了I和II两组。两组的质粒共享编码反应调节转录因子CopR和含HAMP结构域的组氨酸激酶BaeS的基因，该两者构成了肠杆菌科黏菌素耐药的双组分系统，但这种假定的双组分系统是否与mcr-8介导的黏菌素耐药有关，还需要进一步证实。

1. mcr-8携带菌株的分子遗传学分析

为了研究这些mcr-8携带菌株的分子特征，作者进行了多位点序列分型（MLST）、贝叶斯分型、系统发育分型和抗性基因、毒力基因分析。结果表明，这些分离株属于5种不同的ST（ST1、ST3410、ST42、ST2018、ST37），贝叶斯分型将其划分为4种不同的谱系（该结果未显示在图中）。cgSNP系统发育树将这12个菌株分为3个进化树分支的集群（Clusters）。这些结果不仅体现了mcr-8阳性肺炎克雷伯菌的遗传多样性，还表明mcr-8基因可以在不同的肺炎克雷伯菌分离株之间传播，且主要以水平基因转移的方式进行。此外，全基因组测序（WGS）显示这些肺炎克雷伯菌分离株除mcr-8基因以外，还携带有其它类型的抗生素耐药基因，但未发现与肺炎克雷伯菌高毒力相关的毒力基因。

1. 黏菌素耐药的其它机制分析

为了确定除mcr-8基因以外，肺炎克雷伯菌是否还含有其他导致黏菌素耐药的机制，作者使用质粒消除实验成功去除了KP8、KP744和KP4的mcr-8基因携带质粒，这些菌株分别命名为CKP8、CKP744和CKP4。其中CKP8恢复了对黏菌素的敏感性，而CKP744和CKP4仍表现为黏菌素耐药，但耐药性明显降低。MgrB及双组分调控系统PhoP/Q、PmrAB和CrrAB分析表明CKP744和CKP4存在氨基酸突变，这可能与它们的黏菌素耐药有关。

文章结论

1. mcr-8阳性肺炎克雷伯菌在多种不同分型的菌株中被发现，具有遗传多样性；
2. mcr-8基因携带的质粒通常具有水平转移的能力；
3. mcr-8基因携带的质粒通常与IncF复制子相关，但也可能存在IncA/C型的大型杂交质粒中；
4. mcr-8基因携带的菌株可能含有其它抗性基因，介导菌株多重耐药；
5. mcr-8基因携带的菌株通常不具有高毒力；
6. mcr-8基因的侧翼结构可能表现为类似“IS903B-orf-mcr-8.1-orf-IS903B”或“ISEcl1-mcr-8.1-orf-ISKpn26”的形式。

参考文献

Wu B, Wang Y, Ling Z, et al. Heterogeneity and Diversity of mcr-8 Genetic Context in Chicken-Associated Klebsiella pneumoniae [J]. Antimicrob Agents Chemother, 2020, 65(1).

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