碳青霉烯和头孢他啶-阿维巴坦耐药的铜绿假单胞菌的出现

文章标题：Emergence of Ceftazidime- and Avibactam-Resistant Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa in China

文章链接：10.1128/mSystems.00787-21

发表时间：2021.12

发表期刊：mSystems

IF：6.4

研究背景：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）属于最常见的条件致病菌。在临床上，碳青霉烯类药物通常作为治疗PA感染的一线药物。然而目前碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌（CRPA）在临床中越来越多地被发现。头孢他啶-阿维巴坦（CAZ-AVI）也被用于治疗由多重耐药肠杆菌科和铜绿假单胞菌引起的复杂腹腔感染和医院获得性肺炎，且CRPA菌株对CAZ-AVI的敏感性较高。此外，KPC-PA已有相关报道，但是其流行病学特点以及对CAZ-AVI耐药的影响仍有待进一步的研究。

研究对象：KPC阳性的铜绿假单胞菌

研究方法：全基因组测序、药物敏感性检测、质粒消除实验、kraken2方法鉴定质粒、反转录定量PCR、系统发育分析、MLST、比较基因簇分析。

主要研究内容及结果：

1. 地理分布、抗菌药物敏感性和临床数据

作者从国内7家医院收集了374株碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌（CRPA）。其中大多数样本来自重症监护病房和普外科。PCR结果显示151株（40.4%）为bla_KPC阳性，且所有bla_KPC基因均为bla_KPC-2。药敏试验显示，KPC-PA菌株对除CAZ-AVI以外的所有β-内酰胺类药物和氟喹诺酮类药物高水平耐药（>90%）。其中大部分菌株（n = 141/151; 93.4%）符合难治性耐药标准。一半的分离株（n = 76/151;50.3%）对CAZ-AVI耐药。从来源上看，如图1A所示，除PUMCH外，其它所有医院的CRPA分离株均检测到bla_KPC-2基因。

1. 分子流行病学和质粒组成分类

Illumina测序数据显示了151株KPC-PA菌株三种主要的多点序列分型（MLST）：ST463、ST485、ST1212，在不同地理区域占主导地位。ST463主要分布在华东城市（南京、杭州和衢州），而ST485是华中武汉KPC-PA的主要ST。

在CRPA菌株中发现了8种类型的质粒，根据它们的组合情况（Plasmid pattern），所有菌株被分为了13组，命名为模式A至M。其中A型和B型是主要的质粒模式，分别代表只携带I型和II型质粒的菌株。此外，作者发现Plasmid types与ST之间存在关联，I型质粒主要存在于ST463和ST1212菌株中。II型质粒在ST485和ST463菌株中最常见，而VIII型质粒仅在ST1212菌株中携带。

3、 blaKPC-2基因的遗传环境模式分析

作者从每种Plasmid pattern中选择了代表菌株进行Nanopore测序，获得了5种编码KPC的Plasmid Types。基因组分析揭示了这些质粒的共同特征。

首先，尽管质粒类型多样，但blaKPC-2的core genomic platform “ISKpn27-blaKPC-2-ISKpn6”在几乎所有样本中保持一致。blaKPC-2相关的可移动元件有IS26-ΔTn6296和Tn1403-like-ΔTn6296两个原型。两者都属于转座子Tn3家族的Tn21亚家族。相同的blaKPC-2 core platform表明启动子区变异可能对KPC过表达和CAZ-AVI抗性无关（仅菌株FAHZU40和NDTH9845中检测到新的启动子区域）。其次，blaKPC-2 core platform之外的相邻区域因多个IS26介导的反转或复制事件而变化，从而扩大了blaKPC-2基因的数量（质粒pSRRSH1002-KPC和pSRRSH1408-KPC的比较可以支持这一点）。此外，blaKPC-2相关的可移动遗传元件（MGE）整合到染色体中也参与了染色体结构的重塑（菌株NDTH10366染色体三个blaKPC-2-related MGE的串联重复促进了染色体片段的易位）。

1. CAZ-AVI药物敏感性的影响因素分析
2. 基于CRISPR/ cas9的质粒消除实验鉴定bla_KPC-2-related MGE对CAZ-AVI敏感性的影响

由于之前仅挑选了代表性菌株进行Nanopore测序，对于其它菌株bla_KPC-2基因的位置尚不明确，作者使用CRISPR/ cas9的方法来消除菌株的特定类型的质粒。以I型质粒为例，如果消除质粒后PCR无法检测到bla_KPC-2基因，则认为bla_KPC-2基因仅存在于I型质粒上；否则，可能还存在于染色体上或其它质粒上。通过这种方法，作者获得了28株消除I型质粒的菌株，其中有4株仍能检测到bla_KPC-2基因，表明其bla_KPC-2基因已转位到其他复制子上。且这些菌株都恢复了CAZ-AVI敏感性特征。这些结果说明，在大多数情况下，铜绿假单胞的bla_KPC-2基因仅位于一个复制子上，且转位到其他位点的频率较低。此外，多个bla_KPC-2拷贝是铜绿假单胞菌对CAZ-AVI耐药的主要机制。减少拷贝数但不消除所有bla_KPC-2拷贝也可能减轻CAZ-AVI抗性。

1. bla_KPC-2拷贝数对CAZ-AVI抗性的影响

研究发现MIC在2/4～32/4 mg/L时bla_KPC-2基因拷贝数具有统计学差异，但高水平抗性的关系不太明显，可能是由于高水平抗性的样本数较少。KPC表达的定量分析显示CAZ-AVI耐药组的bla_KPC-2表达水平明显高于敏感组。且bla_KPC-2的表达水平与其基因拷贝数和CAZ-AVI的MIC相关。这支持了基因剂量效应，即多个基因拷贝增加了基因表达水平。

1. 其他AMR机制对CAZ-AVI抗性的影响

除bla_KPC-2外，其他染色体ARGs也可能与CAZ-AVI耐药有关。其中能够导致CAZ-AVI耐药的假单胞菌衍生头孢菌素酶(PDC)及其变体未检测到过表达。而外排泵MexAB-OprM和青霉素结合蛋白3 (PBP3)中F533L突变的过表达可能有助于CAZAVI耐药。然而，KPC编码质粒消除后恢复CAZ-AVI敏感性表明这些ARGs对于CAZ-AVI耐药的贡献很小。

文章结论

1、KPC-PA菌株bla_KPC-2基因的core genomic platform为“ISKpn27-bla_KPC-2-ISKpn6”，该结构由“IS26-ΔTn6296”或“Tn1403-like-ΔTn6296”衍生而来。

2、KPC-PA的bla_KPC-2基因一般位于质粒上，但也可能转移至染色体并介导PA染色体重塑。

3、KPC-PA的bla_KPC-2的核心结构在IS26介导的反转或复制事件下可能发生bla_KPC-2基因的多拷贝。

4、bla_KPC-2基因的多拷贝与KPC-PA的CAZ-AVI耐药相关。

参考文献

Zhu Y, Chen J, Shen H, et al. Emergence of Ceftazidime- and Avibactam-Resistant Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-Producing Pseudomonas aeruginosa in China [J]. mSystems, 2021, 6(6): e0078721.

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