GFF和GTF文件的处理和应用

GFF和GTF文件的格式规则和应用场景

GFF（General Feature Format）和GTF（Gene Transfer Format）文件是用于描述基因组注释信息的制表符分隔的文本文件，在信息分析中一般需要从这两种文件中提取所需的注释信息。

GFF文件分为三个版本，其中GFF3是最新的标准，GTF文件实际上是GFF2的一个子集。这两种文件格式都包括了基因组特征的信息，例如基因、外显子、启动子等。

GFF全称为general feature format，这种格式主要是用来注释基因组。
GTF全称为gene transfer format，主要是用来对基因进行注释。

GFF格式规则：

- GFF3中，属性列是键值对形式，用分号分隔。

-包含九列，依次为：序列名、来源、特征、起始位置、终止位置、评分、链、相位和属性，详细描述如下：

seq_id：序列的编号。通常是染色体或者Contig ID，比如：Chr01或者 scaffold_1

source：注释的来源。一般会是预测用软件工具或者数据库

type：类型，此处的名词是相对自由的，建议使用符合SO惯例的名称（sequenceontology），如gene，repeat_region，exon，CDS等

start：上述type起始位点。从1起始计数

end：上述type结束位点

score：type的分数，可以是浮点数或者整数。与早期版本的格式一样，其语义定义不明确。建议将E-value用于序列相似性特征，将P-value用于从头基因预测。

strand：type位于参考序列的正链（+）或者负链（+），或者非链特征（.），对于链相关特征未知的也可以用问号（?）表示

phase：仅对注释类型为“CDS”的有效，表示起始编码的位置，有效值为0、1、2. (对于编码蛋白质的CDS，本列指定下一个密码子的起始位置。每3个核苷酸编码一个氨基酸，从0开始，CDS的长度，除以3，余数就是这个值，表示到达下一个密码子需要跳过的碱基数。“0” 表示密码子从该CDS的5‘端第一个核苷酸开始（即向前0个碱基），“1”相表示密码子从第二个核苷酸开始，“2”相表示密码子从第三个核苷酸开始。注意，GFF3 CDS的phase不应与类似概念frame混淆，frame的概念也是生物信息学中的常见概念。frame通常被计算为相对于完整开放阅读框（ORF）或密码子的开始的给定碱基值，而CDS phase表示相对于给定CDS特征的下一个密码子的开始。)

attributes：格式为tag=value的特征属性列表，不同的属性用分号分隔。一个键可以有多个值，不同值用“,”分割。注意如果描述中包括tab键以及“，=；”，要用URL转义规则进行转义。tag是区分大小写的，以大写字母开头的tag是预先定义好的，在后面可以被其他注释信息调用

GTF格式规则：

-同样包含九列，格式与GFF相似，但属性列的键值对使用空格分隔，并以双引号括起来，详细信息如下：

seqname：序列名称。通常是染色体或者Contig ID，比如：Chr01或者 scaffold_1

source：注释的来源。一般会是预测用软件工具或者数据库

feature：注释信息类型（基因结构），这列信息是必须的，至少包括比如CDS、start_codon、stop_codon，还可以包含5UTR、3UTR、inter、inter_CNS、intron_CNS、exon、mRNA等等

start：上述feature起始位点。从1起始计数

end：上述feature结束位点

score：表示feature的存在和坐标的置信度，可以是一个浮点数或者整数，“.” 表示为空，就是不需要

strand：该feature位于参考序列的正链（+）或者负链（+）

frame：0表示阅读框的第一个完整密码子位于最5’端，1表示在第一个完整密码子之前有一个额外的碱基，2表示在第一整个密码子之前还有两个额外的碱基。注意，frame不是CDS长度除以3的余数（CDS mod 3）。如果链是“-”，则该区域的第一个碱基的值为end，因为对应的编码区域将在反向链上从end到start

attributes：应具有的格式为attribute_name“attribut_value”；，每个属性必须以分号结尾并且与下一个属性之间以空格分隔，并且属性的值应该用双引号包围。并且必须包含以下两个属性：

GTF与GFF比较：

GTF的第九列，通常为：

gene _ id "At1ge0001"; transcript _ id "At1g0ee01.1";

而 GFF的第九列，通常为：

ID =mrnae01; Name = abc ID =exon1; Parent =mrnae01ID =exon2; Parent =mrnae01

使用gffread软件可实现gtf和gff文件互转和序列提取：

gffread软件安装

方法一：conda安装

conda install bioconda::gffread -y

方法二：编译安装

# gffread软件的下载和编译

git clone https://github.com/gpertea/gffread

cd gffread

make release

#将gffread安装路径添加到环境变量（临时），需将此处路径替换为实际路径

export PATH="/mnt/Share/mawulin/class/class3/data/gffread:$PATH"

#查看帮助信息（检查安装是否成功）

gffread -h

常用参数介绍：

-g 序列文件，即GFF/GTF文件第一列ID对应的序列文件。

-i 丢弃掉内含子大于的转录本（mRNA/transcript）

-r 起始和终止位置，填写示例100.10000即为输出与100到10000有重叠的所有转录组，也可以限制序列ID及链，填写示例：+Chr1:100..10000。

-R 丢弃掉此范围的转录本，与-r相反。

-U 丢弃掉 single-exon的转录本

-C 丢低调无CDS的转录本。

-V 丢弃掉含有移码突变的转录本。

-H 如果使用了-V，则重新检查并调整内含子相位，避免由于翻译起始位点选择的位置不对导致移码突变的产生。

-B 如果使用了-V， 对于单外显子基因，则重新检查相反的链，是否存在移码突变。

-N 丢弃掉多外显子基因剪接位点不是常见的 GT-AG, GC-AG or AT-AC序列。

-J 丢弃掉没有起始密码子或者终止密码子的转录本，仅保留有完整编码框的转录本。

--no-pseudo: 过滤掉含有 'pseudo'的注释信息

-M/--merge : 合并完全相同的或者存在包含关系的转录本。

-d:使用 -M 将合并信息输出到文件中

--cluster-only:类似于 --merge但是不合并转录本

-K 对于-M选项：also collapse shorter, fully contained transcripts with fewer introns than the container

-Q 对于-M选项：移除包含关系的转录本的限制条件：多外显子转录本将会合并，如果他们内含子位置完全一样，单外显子转录本只需要有80%一样即可合并。

--force-exons: 使GFF features的最小层级为exon

-E 对于重复的 ID或者 GFF/GTF其他潜在的格式问题给出警告信息。

-Z 将内含子小于4 bp的邻近的两个外显子合并为一个。

-w 输出每个转录本的外显子序列

-x 输出CDS序列

-W 对于 -w和 -x选项，输出外显子位置坐标到FASTA序列的ID中

-y 输出蛋白质序列

-L 将Ensembl GTF转换为 GFF3 conversion (implies -F; should be used with -m)

-o 输出"filtered"后的GFF文件。

-T -o参数将输出 GTF格式。

#查看示例数据

# GFF转换GTF

gffread examples/annotation.gff -T -o out.gtf

# GTF转换GFF3

gffread examples/transcripts.gtf -o out.gff3

#根据GFF或者GTF提取CDS，蛋白质和外显子序列

gffread examples/annotation.gff -g examples/genome.fa -x cds.fa -y pep.fa -w cdna.fa

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