文献解读丨质粒携带的RND外排泵介导肺炎克雷伯菌替加环素耐药

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2023-11-23 10:00:55
原创

文章题目：Emergence of a Plasmid-Encoded Resistance-Nodulation-Division Efflux Pump Conferring Resistance to Multiple Drugs, Including Tigecycline, in Klebsiella pneumoniae

文章链接：10.1128/mBio.02930-19

发表时间：2020.3

发表期刊：mBio

IF：6.4

研究背景：编码耐药结节化细胞分化（RND）超家族型外排泵的基因簇从染色体到质粒的共转移并不常见，并且尚未发现质粒介导的RND外排泵基因簇赋予对替加环素的抗性。本研究在动物源肺炎克雷伯菌的质粒上发现了一种新的RND外排泵基因簇，命名为tmexCD1-toprJ1，它可以介导四环素类药物，包括替加环素和依拉环素的抗性。
研究对象：tmexCD1-toprJ1阳性的肺炎克雷伯菌
研究方法：全基因组测序、系统发育分析、遗传背景分析、分子克隆、细菌生长试验、接合转移试验、质粒稳定性试验、抗生素体内累积试验、小鼠感染试验。

主要研究内容及结果：

1、研究基础

研究者于2017年从安徽省一养鸡场的5只12日龄健康鸡的粪便样本中分离出5株肺炎克雷伯菌（AH6I、AH8I、AH25I、AH28I、 AH33I）。它们对所有检测的抗生素均耐药或不敏感，包括替加环素。全基因组测序或PCR和Sanger测序显示这些菌株均携带β-内酰胺类(bla_NDM-1)、黏菌素(mcr-1.1、 mcr-8.1)、氨基糖苷类(armA)的耐药基因，且未发现引起替加环素耐药的ramR、acrR、rpsJ或tet(A)基因突变。但在添加外排泵抑制剂1-(1-萘甲基)哌嗪（NMP）后，5个分离株的替加环素MIC降低64-128倍，说明这些菌株的替加环素耐药与外排泵密切相关。

2、代表性菌株基因组测序分析

全基因组测序显示AH8I的pHNAH8I-1质粒携带mcr-8.1、strAB基因和一个6.5 kb的三段式外排泵编码区，该区域与铜绿假单胞菌PAO1的MexCD-OprJ氨基酸一致性为64.5%至77.8%，其毗邻的ORF编码转录调控因子，被注释为nfxB。由于该基因簇由质粒携带且可发生转移（t），因此外排泵被命名为tnfxB1-tmexCD1-toprJ1。此外，作者通过重组质粒转化实验确定了tnfxB1- tmexcd1 -toprJ1可赋予菌株替加环素耐药性。

3、TMexCD1-TOprJ1外排泵对细菌的影响外排泵功能验证：

外排泵功能验证：为了证实TMexCD1-TOprJ1具有外排泵的功能，作者分别测定了TMexCD1-TOprJ1阳性与阴性菌株替加环素的体内积累情况，发现携带tnfxB-tmexcd1-toprJ1的菌株总是比阴性对照菌株的替加环素平均药物浓度低。且在添加了外排泵抑制剂后，两者的胞内药物浓度均迅速增加（图1a）。

体内治疗效果评价：为了评估TMexCD1-TOprJ1是否影响替加环素的体内治疗效果，将对替加环素敏感的肺炎克雷伯菌AH58I与携带TMexCD1-TOprJ1质粒的pHNAH8I-1菌株注射到小鼠大腿肌肉中。替加环素处理36小时后，观察到AH58I细胞浓度明显下降，AH58I/pHNAH8I-1细胞浓度下降幅度低，且两者具有显著差异。这一结果表明TMexCD1-TOprJ1确实赋予了菌株对替加环素的耐药性，并可能导致替加环素治疗失败。

图1 TMexCD1-TOprJ1对替加环素的体内外活性研究（a. 细菌体内替加环素积累；b. 替加环素治疗下的细菌细胞浓度差异

细菌生长状态影响：为了评估TMexCD1-TOprJ1是否影响肠杆菌科细菌的生长状态，作者分别测试了TMexCD1-TOprJ1对于肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和鼠伤寒沙门氏菌生长状态的影响。结果显示TMexCD1-TOprJ1的表达对肺炎克雷伯菌的生长没有影响，但对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的生长有抑制作用。

4、代表性菌株基因组测序分析系统发育树分析：

系统发育树分析：为了阐明tnfxB1-tmexCD1-toprJ1 RND外排泵复合物的起源和进化关系，作者将主要功能转运体蛋白TMexD1与GenBank中的相关蛋白进行了比较。由此产生的邻接树将TMexD1置于具有高氨基酸同一性（90%）的系统发育群中。包括来自Pseudomonasspecies的14个染色体基因和18个质粒携带基因的编码蛋白，表明tmexCD1-prJ1可能起源于某个Pseudomonasspecies。

pHNAH8I-1质粒的特征分析：基因组图4a揭示了pHNAH8I-1质粒的基因组序列特征排布，该质粒与肺炎克雷伯菌分离株KP91的pKP91质粒关系最为密切，两者均含有mcr-8.1。接合转移实验确定该pHNAH8I-1具有水平转移的能力，然而质粒稳定性结果表明，在没有替加环素选择的情况下，pHNAH8I-1虽然可以在肺炎克雷伯菌中稳定存在，但在大肠杆菌中却不一定。

tnfxB1-tmexCD1-toprJ1遗传背景分析：在pHNAH8I-1中，tnfxB1-tmexCD1-toprJ1簇位于转座子Tn5393内部，同时插入的还有2个位点特异性整合酶基因（int）和两个功能未知的基因（hp1和hp2）。基于整合酶捕获和转移大片段DNA的特性，作者推测该整合酶可能负责通过质粒从假单胞菌的染色体获得tnfxB1-tmexCD1-toprJ1及其变体。

图3 TMexD1和TMexD1样蛋白的系统发育树（编码基因位置：橙色-染色体；绿色-质粒；蓝色-染色体；黑色-无法确定）

5、tnfxB1-tmexCD1-toprJ1外排泵流行性调查

在临床分离的2575株肺炎克雷伯菌中，仅2018年从胆囊和肺样本中分离的两个菌株（0.08%，ST15）表现为tmexCD1-toprJ1阳性。3810份食品动物和零售肉类样本显示了更高的阳性率（11.7%），且其中绝大部分来源于肺炎克雷伯菌（415株）。说明tnfxB1-tmexCD1-toprJ1主要分布于动物源的克雷伯菌中。

文章结论

tnfxB1-tmexcd1-toprJ1是一种新型的质粒介导的RND多重耐药外排泵系统，可介导菌株对替加环素、依拉环素的耐药性，并降低其它抗菌药物的敏感性。tmexCD1-toprJ1及其变体可能来源于假单胞菌的染色体，且由于其携带质粒的转移特性可能在肠杆菌科细菌中进一步传播。目前国内tnfxB1-tmexcd1-toprJ1在食品动物源的肺炎克雷伯菌中存在较为广泛，但临床上发现极为有限，因此要谨防tnfxB1-tmexcd1-toprJ1阳性的肺炎克雷伯菌从食品动物向人的传播。

参考文献

Lv L, Wan M, Wang C, et al. Emergence of a Plasmid-Encoded Resistance-Nodulation-Division Efflux Pump Conferring Resistance to Multiple Drugs, Including Tigecycline, in Klebsiella pneumoniae [J]. mBio, 2020, 11(2).

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