文献解读 | 高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌院内传播和演化的追踪研究

文章题目：Chasing the landscape for intrahospital transmission and evolution of hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

文章链接：doi: 10.1016/j.scib.2023.10.038

发表时间：2023.12

发表期刊：Sci Bull (Beijing)

IF：18.9

研究背景/目的：碳青霉耐药高毒肺炎克雷伯菌主要存在三种形式。①K1/K2 hvKP获得碳青霉烯耐药质粒，称为CR-hvKP；② ST11 CRKP获得pLVPK-like毒力质粒，称为hv-CRKP；③部分菌株携带毒力和耐药的融合质粒。ST11 hv-CRKP的高传播性是医院的主要威胁，近年来，其优势克隆从ST11-K47向ST11-K64转变（图1）。本文主要针对hv-CRKP克隆的院内传播情况，KPC-2和毒力的趋同进化，以及rmpA的启动子异质性展开了研究。

研究对象：90株CRKP临床分离株

研究方法： PCR、16S rDNA测序、拉丝试验、MLST、PFGE、S1-PFGE and Southern blot、质粒测序、比较基因簇分析、启动子活性检验、质粒固化、CRISPR/Cas9编辑、小鼠感染试验、病理切片。

图1 hvKP、CRKP的遗传学特征及CR-hvKP/hv-CRKP的发现历程

主要研究内容及结果：

1、菌株来源

本研究分离株来源于浙江大学医学院第二附属医院ICU的回顾性临床分析。研究选取2017～2022年普通ICU病房确诊为CRKP携带者的72例住院患者（男53例，女19例），除6例患者未接受任何抗生素治疗外，大多数（43/72）患者接受了碳青霉烯类等各种抗生素治疗。必要时，可能会与替加环素或黏菌素联合使用。共获得90株CRKP分离株，其中大多数来自痰液（45/90）和粪便（27/90）样品。

2、CRKP的克隆传播和毒力情况

经PCR鉴定，在90个CRKP分离株中，有87个表现为bla_KPC-2阳性，其余3个菌株携带bla_NDM-5基因。PFGE将90个CRKP分离株分为6个亚分支（分支A-F）。MLST包括6种分型，最常见的是ST11和ST15；荚膜分型主要为K64，其次是K24。从上述结果来看，ST11-K64克隆主导了2017年～2022年KPC-2 CRKP的院内传播。

通过对各种毒力基因（rmpA/rmpA2、iutAiucABCD和iroBCDN）的多重PCR分析，发现如下特征：①46个含有完整rmpA基因的分离株全部来自ST11-K64；②大多数CRKP分离株具有截短的rmpA2或rmpA2可能发生3种类型的移码突变（RmpA2-M2, 99aa; RmpA2-M3, 114aa; RmpA2-M4, 100aa）；③仅有9株CRKP分离株呈拉丝试验阳性，且它们都属于ST11-K64。这些发现表明产KPC-2的CRKP菌株在毒力方面可能发生了进化或分化。

图2 90株临床CRKP的XbaI-PFGE分析及菌株信息统计

3、典型hv-CRKP菌株的遗传特征

分离株CRKP-11和CRKP-21是ST11-K64 CRKP获得双元质粒的典型菌株。两者携带的质粒pCRKP-11_KPC与pCRKP-21_KPC，pCRKP-11_Vir与pCRKP-21_Vir几乎完全相同，但CRKP-11表现为拉丝试验阳性，而CRKP-21为拉丝试验阴性。推测可能是rmpA的表达在CRKP-11和CRKP-21之间存在显著差异。

图3 ST11 hv-CRKP毒力质粒的遗传和基因组特征

4、新型bla_KPC-2-rmpA融合质粒分析

除ST11 hv-CRKP分别携带bla_KPC-2和rmpA质粒的这种常见情况以外，作者还发现了两个不同寻常的ST11克隆（CRKP-08和CRKP-48），两者都携带有bla_KPC-2-rmpA融合质粒，属于IncFII/ IncR复制子类型。且CRKP-08的pCRKP-08_KPC_vir相比CRKP-48的pCRKP-48_KPC_vir质粒多一个rmpA拷贝，以及 rmtB、bla_SHV-12、bla_TEM-1B、bla_CTX-M-65四个耐药基因。

图4 bla_KPC-2-rmpA杂合质粒的遗传和基因组分析

比较基因组学分析显示，pCRKP-08_KPC_vir的序列分别与pCRKP-21_KPC和 pCRKP-21_Vir匹配，且其IS5075和HR两个同源序列分别位于pCRKP-21_KPC和pCRKP-21_Vir的同源序列边界。同理pCRKP-48_KPC_vir也可以追溯到pCRKP-11_KPC样的质粒。

基于这些发现，研究者提出了两种质粒重组模型（图5b和6b）。pCRKP-08_KPC_vir的形成与IS5075和HR所介导的同源重组有关；pCRKP-48_KPC_vir的形成可能涉及两组转座事件，IS26介导pCRKP-11_KPC上bla_{KPC -2}片段的倒置，及IS1辅助转座倒置pCRKP11_Vir上的毒力区，之后同样基于IS5075和HR介导的同源重组形成融合质粒。由于同源的CRKP-11/21/08/48都是本医院的临床分离株，这样的结果代表了ST11 hv-CRKP群体在该医院内可能存在明显的传播和进化。

图5碳青霉烯耐药毒力融合质粒pCRKP-08_KPC_Vir的基因组分析及遗传模型

图6碳青霉烯耐药毒力融合质粒pCRKP-48_KPC_Vir的基因组分析及遗传模型

5、rmpA启动子的异质性分析

前文所述在46个携带完整rmpA的ST11-K64克隆中，只有9个是高黏性的，CRKP-08的融合质粒上甚至有2个rmpA，但仍然表现为拉丝试验阴性。为回答该问题，作者对全部90株CRKP分离菌的rmpA启动子进行了PCR扩增和Sanger测序，结果发现不同克隆的rmpA启动子仅在-10和-35位点之间的poly(T) track上存在差异，比如无黏性的CRKP-08是P_10T，高黏性的CRKP-48是P_11T。且大多数ST11-K64克隆的rmpA启动子（37/46）属于P_10T，无黏性，而9个高黏性分离株的P_10T都被P_11T所取代。

为验证P_10T作为rmpA启动子，其功能是否弱于P_11T，作者构建了如图7c所示的pAH125-PrmpA-lacZ融合质粒，在pINTts整合酶的作用下，PrmpA-lacZ片段可以整合在MC4100的染色体上。正如预期的那样，P11T启动子的活性显著强于P_10T（图7e）。因此，P_10T弱启动子可能无法有效地产生RmpA毒力因子，导致无高黏表型。

为进一步确定不同rmpA启动子的全球分布，作者在NCBI数据库中查询了rmpA序列，截至2023年1月26日，所有rmpA启动子可以分成5种，并以P_11T为主（图7a, 7b）。K1/K2毒力株的rmpA启动子大部分属于P_11T和P_12T（92/105），ST11 CRKP克隆的rmpA启动子主要由P_10T（35/80）和 P11T（41/80）构成。且在ST11 CRKP rmpA-plusK. pneumoniae中，K64仍然是主要的荚膜类型（74/80）。

就该作者所知，这项研究第一次提供功能性证据，证明rmpA启动子的功能获得和功能丧失突变参与了ST11 CRKP临床克隆株的毒力进化。

图7不同K. pneumoniae的rmpA启动子分布及功能分析

通过质粒固化试验和CRISPR/cas9系统，作者分别获得了消除rmpA质粒的#21-PC（亲本为CRKP-21），以及发生ΔrmpA框内缺失的#11(ΔrmpA)和#48(ΔrmpA)菌株。这三个菌株均未出现生长减缓的情况，说明rmpA基因在细菌适应性代价中不起作用（图8e）。

小鼠杀伤实验显示，无论P_T10-rmpA毒力质粒（pCRKP-21_Vir）是否存在，所有小鼠在感染的第5天都仍然存活，而CRKP-11和CRKP-48组在5天内均出现80%的致死率。且P_T11-rmpA调节因子失活后，CRKP-11和CRKP-48的毒力受损。

图8基于小鼠感染模型评价rmpA在K. pneumoniae临床分离株毒力中的作用

组织病理学分析从感染小鼠的肝脏和肾脏组织中取样，进行HE染色。K15感染组（对照组）的病理切片显示了hvKP感染的典型综合征，包括但不限于肝脏炎性细胞浸润和充血部位（图9a），以及肾切片中的脓肿病变（图9b）。在感染携带P_T11-rmpA调节子的毒力株CRKP-11和CRKP-48组中也观察到相似的肝/肾严重疾病。相反，CRKP-21感染组的肝和肾样本始终检测到正常细胞/组织结构，与无毒变异株#21-PC、#11（ΔrmpA）和#48（ΔrmpA）类似。

综上所述，活性P_T11-rmpA调控因子是ST11-K64 CRKP克隆高毒力的原因。

图9 CRKP感染小鼠的病理特征（K15为阳性对照）

文章结论

本研究提出了2种新的bla_KPC-2-rmpA质粒融合模型。首次发现了5种rmpA启动子（P9T至P13T），并证明具有完整rmpA的活性rmpA启动子可导致菌株高黏性，这同时也是高毒力的特征。

参考文献

Liu L, Lou N, Liang Q, et al. Chasing the landscape for intrahospital transmission and evolution of hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae [J]. Sci Bull (Beijing), 2023, 68(23): 3027-47.

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